太平洋鱈(Gadus macrocephalus)精液超低溫冷凍方法的建立及精子超微結構分析*

韓龍江 劉清華 于道德 官曙光 紀利芹王文琪 劉 名 溫海深① 李 軍①

(1.中國科學院海洋研究所 青島 266071;2.中國海洋大學水產學院 青島 266003;3.山東省海水養殖研究所 青島 266002;4.青島農業大學海洋科學與工程學院 青島 266109)

太平洋鱈(Gadus macrocephalus)屬于脊椎動物門(Vertebrata)、真骨魚綱(Division Teleostei)、鱈形目(Gadiformes)、鱈科(Gadidae)、鱈屬(Gadus),是太平洋中下層的冷水性魚類,在我國主要分布于渤海、黃海及東海北部(高天翔等,2003)。鱈魚是一種重要的世界性經濟魚類,近年來,由于過度捕撈、環境污染日趨嚴重,太平洋鱈種群遭到嚴重破壞,自然資源衰退嚴重,因此,完善鱈魚人工繁育和養殖技術對滿足鱈魚的需求具有重要意義。

目前國內對鱈魚的研究處于起步階段,只有少數學者對鱈魚的形態學進行了研究(高天翔等,2002)。而鱈魚人工繁育方面的研究較少,有待加強。

魚類的精子冷凍在保護物種多樣性方面具有廣泛的應用前景,魚類精液的超低溫冷凍保存對于提高魚類種質、選擇培育優質魚種具有重要意義:首先可避免近親交配,突破地理隔離,擴大雜交組合范圍(于海濤等,2004);其次通過該技術可將一些瀕危、名貴、優良魚種的精液保存起來,建立魚類精子原種庫,保護魚類的種質資源(蘇天鳳等,2004;陳亞坤等,2010;Chenet al,2010);此外,新鮮精液經超低溫冷凍后,質量差的精子更容易被凍死,復蘇的精子平均質量得到提高,提高了種群質量(Buttset al,2010)。因此,隨著海水養殖業的發展,我國迫切需要建立海洋生物種質資源保護體系(張軒杰,1987),自20世紀80年代開始,我國主要在淡水魚類精子冷凍方面(陳松林等,1992)進行了一定研究,近幾年在海水魚類精液的冷凍保存方面也取得了巨大的進展,對一些具有較高經濟價值魚類,如真鯛(Pagrus major)(Liuet al,2007)、黑鯛(Sparus macrocephalus)(葉霆等,2009)、大菱鲆(Scophamus maximus)(Chenet al,2004)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)(Zhanget al,2003)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Pérez-Cerezaleset al,2010)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)(田永勝等,2009)等,進行了一系列的精子超低溫保存研究,而對太平洋鱈精子冷凍保存的研究未見報道。因此,本實驗擬建立了太平洋鱈精子冷凍方法,并通過電子顯微鏡對凍精超微結構的損傷做了初步觀察。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

實驗所用太平洋鱈于2013年2月份在青島近海捕獲后暫養于山東省海水養殖研究所膠南增養殖站養殖車間,實驗時將性腺發育良好的雄性親魚(體重1800—2500g)從養殖池中撈出,放置于海綿上,蒸餾水沖洗生殖孔三次,紙巾擦凈,輕輕從后向前擠壓腹部獲得3尾雄魚的新鮮精液約150mL,存于干凈避光的離心管中,顯微鏡檢測活力,計算機輔助精子分析(computer-assisted sperm analysis,CASA)檢測運動率高于90%的樣品置于冰盒中帶回實驗室進行冷凍保存。

1.2 實驗方法

將采集的新鮮精液經稀釋液稀釋,選取5種不同的抗凍劑(PG(丙二醇)、DMSO(二甲基亞砜)、EG(乙二醇)、GLY(甘油)、MeOH(甲醇),DMSO 購自 SIGMA公司,其它藥品均購自國藥集團化學試劑有限公司)配成六個不同的濃度(8%、10%、12%、14%、16%、18%),提前一天置于4°C冰箱預冷過夜。將采集來的新鮮鱈魚精液與冷凍保護液按1︰3的比例裝入2mL的凍存管中(Liuet al,2006),4°C平衡5min使抗凍劑充分滲透進精子細胞后立即放入程序降溫儀中(型號Kryo-360-1.7),以-12°C/min的降溫速率從 0°C 降至-80°C,平衡5min后再以-20°C/min的降溫速率降至-180°C后直接投入液氮中保存。每一實驗組設三個平行,實驗重復三次。

1.3 鮮精與凍精的活力測定

鮮精活力的測定:吸取 1—2μL新鮮精液在添加有 100μL10%(v/v)胎牛血清(BSA)的過濾海水中激活,顯微鏡檢測活力,采用計算機輔助精子分析(CASA)統計精子的運動率、平均直線速度、平均曲線速度、平均圓周速度等指標(劉清華等,2006)。

凍精活力的測定:將存有精液的凍存管直接放入 37°C水浴中解凍 100—110s,然后置于室溫(18—20°C)條件下完全融化,在添加有 10%(v/v)BSA 的過濾海水中激活。具體操作為向載玻片中滴入 100μL海水,然后加入1—2μL凍精,吸打3—5次使其充分混勻,隨機取6個視野,檢測運動精子的數量占視野中所有精子總數的比例,采用CASA統計精子的運動率、平均直線速度、平均曲線速度、平均圓周速度等指標(劉清華等,2006)。運動率是指解凍后精子與激活液(添加有10%BSA的過濾海水)混合后立即于光學顯微鏡(型號 Nikon-YS-100)下觀察同一視野中運動精子數量占全部精子的百分比。

1.4 鮮精與凍精的超微結構觀察

掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察:取鮮精與凍融精液,用 2.5%的戊二醛(4°C)固定24h,經磷酸緩沖液(0.2mol/L,pH=7.4)漂洗后,用1%鋨酸(4°C)固定 2h,然后依次經梯度酒精脫水、醋酸異戊脂置換、離子鍍膜等步驟后,于日本電子株式會社(JEOL公司)的JSM-840型掃描電鏡下觀察、拍照。

透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察:取鮮精與凍融精液,用 2.5%戊二醛(0.2mol/L,pH=7.4,磷酸緩沖液配制)進行前固定,然后用 1%鋨酸(4°C)固定 2h,梯度酒精脫水,然后用 Epon-812滲透包埋,超薄切片機切片,經醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后透射電鏡(日立H-7000)下觀察、拍照。

1.5 數據處理

實驗數據分析采用SPSS17.0軟件進行單因素方差(One-Way ANOVA)分析,比較實驗結果差異顯著性,結果以平均值±標準差表示,多重比較采Duncan法。

2 結果

2.1 添加劑蛋黃對精子運動率的作用

在PG和DMSO中添加蛋黃對精子運動率的影響分別見圖1和圖2。由圖1可以看出,在各濃度下,添加蛋黃后的 PG精子運動率顯著高于未添加蛋黃的PG(P＜0.05),且在 12%濃度下達到最大值,與其余各組差異顯著(P＜0.05)。由圖2可以看出,8%濃度下,DMSO 組精子運動率高于(DMSO+蛋黃)組,但無顯著差異(P＞0.05);在 10%、14%、16%、18%濃度下,(DMSO+蛋黃)組精子運動率高于 DMSO 組,且在10%、16%、18%濃度下有顯著性差異(P＜0.05),在14%濃度下無顯著性差異(P＞0.05);12%濃度下,DMSO 組精子運動率高于(DMSO+蛋黃)組,且差異顯著(P＜0.05);綜合比較可知,各組中的精子運動率在 10%濃度下的(DMSO+蛋黃)組達到最大值,且與其余各組差異顯著(P＜0.05)。

圖1 添加蛋黃的丙二醇對精子運動率的影響Fig.1 Effect of adding yolk into propylene glycol on motility ofGadus macrocephalus sperm

圖2 添加蛋黃的二甲基亞砜對精子運動率的影響Fig.2 Effect of adding yolk into dimethyl sulfoxide on motility of G.macrocephalus sperm

圖3 不同抗凍劑不同濃度下精子的運動率Fig.3 Motility of G.macrocephalus sperm in different cryoprotectants at different concentrations

2.2 抗凍劑種類和濃度對運動率的影響

不同種類的抗凍劑對太平洋鱈精子運動率的影響見圖3(MeOH實驗組精子解凍后基本全部死亡,故沒有數據)。由圖3可知,在8%、12%、14%、16%、18%濃度下,(PG+蛋黃)組太平洋鱈凍魚精運動率顯著高于其他實驗組(P＜0.05)。在10%濃度下,(DMSO+蛋黃組)太平洋鱈凍精運動率顯著高于其他實驗組(P＜0.05)。分別將六個濃度下運動率最高的實驗組進行差異性比較,即濃度為8%、12%、14%、16%、18%的(PG+蛋黃)組與 10%濃度的(DMSO+蛋黃)組相比,12%濃度下的(PG+蛋黃)組中凍精運動率達到最大值85.87%±1.6%,顯著高于其他實驗組(P＜0.05)。

2.3 抗凍劑種類和濃度對精子活力的影響

不同種類的抗凍劑對太平洋鱈凍精平均直線速度的影響見圖4:8%濃度下,(GLY＋蛋黃)組精子平均直線速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05);10%濃度下,(DMSO＋蛋黃)組精子平均直線速度高于其他實驗組,與(PG+蛋黃)組、(EG+蛋黃)組差異顯著(P＜0.05),但與鮮精、(DMSO+蛋黃)組差異不顯著(P＞0.05);12%濃度下,(DMSO+蛋黃)組精子平均直線速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05);14%濃度下,(PG+蛋黃)組精子平均直線速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05);16%濃度下,鮮精實驗組精子平均直線速度高于其他實驗組,與(PG+蛋黃)、(EG+蛋黃)、(GLY＋蛋黃)組差異顯著,但與(DMSO+蛋黃)組差異不顯著(P＞0.05);18%濃度下,鮮精實驗組精子平均直線速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05)。分別將六個濃度下精子平均直線速度最大的實驗組進行差異性比較,即8%(GLY＋蛋黃)、10%(GLY＋蛋黃)、18%(GLY＋蛋黃)、12%(DMSO+蛋黃)、14%(PG+蛋黃)、鮮精相比,12%(DMSO+蛋黃)精子平均直線速度達到最大值(120.39±20.78)μm/s,顯著高于其他實驗組(P＜0.05)。

圖4 不同抗凍劑不同濃度下精子的平均直線速度Fig.4 Average linear velocity of G.macrocephalus sperm in different cryoprotectants at different concentrations

圖5 不同抗凍劑不同濃度下精子的平均曲線速度Fig.5 Average curve velocity of G.macrocephalus sperm in different cryoprotectants at different concentrations

不同種類的抗凍劑對太平洋鱈凍精平均曲線速度的影響見圖5:8%濃度下,(GLY＋蛋黃)組精子平均曲線速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05);10%濃度下,(DMSO＋蛋黃)組精子平均曲線速度高于其他實驗組,與(PG+蛋黃)組、(EG+蛋黃)組差異顯著,但與鮮精、(GLY+蛋黃)組差異不顯著(P＞0.05);12%濃度下,(DMSO+蛋黃)組精子平均曲線速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05);14%濃度下,(PG+蛋黃)組精子平均曲線速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05);16%濃度下,(DMSO+蛋黃)組精子平均曲線速度高于其他實驗組,與(PG+蛋黃)、(EG+蛋黃)、(GLY＋蛋黃)組差異顯著,且與鮮精差異不顯著(P＞0.05);18%濃度下,鮮精實驗組精子平均曲線速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05)。分別將六個濃度下精子平均曲線速度最大的實驗組進行差異性比較,即 8%(GLY＋蛋黃)、10%(DMSO+蛋黃)、12%(DMSO+蛋黃)、16%(DMSO+蛋黃)、14%(PG+蛋黃)、鮮精六組相比,12%(DMSO+蛋黃)精子平均曲線速度最大(155.64±12.02)μm/s,顯著高于其他實驗組(P＜0.05)。

不同種類的抗凍劑對太平洋鱈凍精平均路徑速度的影響見圖6:8%濃度下,(GLY＋蛋黃)組精子平均路徑速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05);10%、12%濃度下,(DMSO＋蛋黃)組精子平均路徑速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05);14%濃度下,(PG+蛋黃)組精子平均直線速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05);16%、18%濃度下,鮮精實驗組精子平均路徑速度顯著高于其他實驗組(P＜0.05)。分別將六個濃度下精子平均路徑速度最大的實驗組進行差異性比較,即 8%(GLY＋蛋黃)、10%(DMSO+蛋黃)、12%(DMSO+蛋黃)、14%(PG+蛋黃)、16%鮮精、18%鮮精六組相比,12%(DMSO+蛋黃)精子的平均路徑速度最大(157.43±6.02)μm/s,顯著高于其他實驗組(P＜0.05)。

圖6 不同抗凍劑不同濃度下精子平均路徑速度Fig.6 Average path velocity of G.macrocephalus sperm in different cryoprotectants at different concentrations

2.4 太平洋鱈鮮精及凍精的超微結構

通過掃描電鏡和透射電鏡觀察新鮮和凍融后的鱈魚精子發現,鮮精中 75.5%精子形態結構正常,24.5%精子形態結構異常;運動率最高的凍精中 67%精子形態結構正常,33%精子形態結構異常。

2.4.1 掃描電鏡觀察結構正常和異常的精子 掃描電鏡觀察結構正常的太平洋鱈精子:由頭部、中段和尾部組成,頭部扁圓略呈梭型,長約 2μm,寬約 1μm,形態正常無膨脹,中段不明顯,線粒體部分位于精子頭部和鞭毛連接處,形態完整,鞭毛細長無斷裂,長約 18.0μm,質膜與核膜結構完整(圖7A—D)。

掃描電鏡觀察太平洋鱈精子結構異常,主要表現在精子頭部、線粒體和鞭毛的變化上。精子頭部結構異常主要體現在:精子頭部破裂,表面褶皺不平滑,胞膜破損變形,細胞質流失,細胞脫水皺縮,細胞器分散(圖7E,G),線粒體結構異常主要體現在線粒體脫落、移位(圖7H)等。鞭毛結構異常主要體現在鞭毛脫落、折斷(圖7F)。

2.4.2 透射電鏡觀察結構正常和結構異常的精子透射電鏡觀察發現,正常精子頭部中央是袖套腔,后端為袖套,細胞核致密,呈卵橢圓形,核長徑約5μm。核染色質密集,染色較深(圖8A,C)。核泡位于核內相對疏松、染色較淺的區域,靠近鞭毛有排列不規則且不在同一平面的線粒體(圖8D),精子尾部有細長的鞭毛,由9組二聯微管構成,中央有一對微管,為典型的“9+2”微管結構(圖8H)。精子質膜與核膜結構完整,嵴發達(圖8B)。

透射電鏡觀察發現核內部結構異常主要表現在:核膜脫落、間斷、局部破裂、皺縮(圖8E,F),核局部受損、染色質變松散、顏色變淺(圖8E);線粒體結構異常表現為:內部結構彌散、線粒體破裂、嵴膜破損(圖8G);鞭毛結構異常主要表現為被膜破裂、皺縮(圖8H)。

圖7 太平洋鱈精子掃描電鏡觀察Fig.7 SEM image showing ultrastructure of spermatozoa of G. macrocephalus

圖8 太平洋鱈精子透射電鏡觀察Fig.8 TEM image showing ultrastructure of spermatozoa of G.macrocep halus

3 討論

3.1 添加劑蛋黃對精子冷凍的影響

添加劑在精子冷凍保存過程中起著重要作用,其主要功能是保護精細胞膜不受損傷,減少抗凍劑的毒性,延長精子的保存期限等。最常見的添加劑有二糖(海藻糖,蔗糖,葡萄糖)、微量添加劑(維生素、抗生素)、血清以及蛋黃等。蛋黃作為外部滲透的化合物,在冷凍或解凍過程中起到防止質膜損壞的作用。在大西洋鱈(Gadus morhua)(Buttset al,2010)精子冷凍過程中,用含有蛋黃的 PG做抗凍劑,凍融后精子具有最高的運動率。在太平洋鱈精子冷凍方法的篩選中,本研究結果表明,以蛋黃作為添加劑,PG為抗凍劑,與沒有添加蛋黃的PG抗凍劑相比能夠顯著提高太平洋鱈精子冷凍保存效果,以蛋黃為添加劑的抗凍劑 DMSO與沒添加蛋黃的抗凍劑的 DMSO在10%、16%、18%濃度下相比,冷凍保存效果顯著提高(P＜0.05)。所以,由本實驗數據可以得出結論:選擇蛋黃作為添加劑能顯著提高太平洋鱈的精子冷凍保存效果,這與其他不同魚類精子冷凍保存中,添加蛋黃能夠顯著提高精子冷凍保存的效果相一致。由于蛋黃中含有豐富的膽固醇、磷脂等物質,與精子細胞膜結構組成物質相類似,作為一種細胞外的添加劑,能夠顯著升高細胞外溶質的濃度,減少溶質深入細胞的量,以降低溶質損傷的程度。另外,蛋黃作為一種天然優良的抗凍添加劑,毒性小,冷凍前可以使細胞大量脫水,增加總的抗凍劑濃度,可在冷凍時緩解細胞內冰晶的形成。

3.2 抗凍劑種類和濃度對精子活力的影響

抗凍保護劑主要是通過滲入精子細胞,調節精子細胞滲透壓,降低精子的冰點,以減少冰晶損傷的方式起到保護精子的作用(陳松林等,2002)。不同魚類的最適抗凍保護劑種類不同(Comizzoliet al,2012),常用的抗凍保護劑主要有GLY、DMSO、EG、PG、MeOH、二甲基乙酰胺(MDA)(陳松林等,1992;李純等,2000;汪小鋒等,2003;Groisonet al,2010;Daiet al,2012)等。抗凍保護劑濃度亦是影響精液冷凍保存的一個重要因素,抗凍保護劑對魚類貝類精子會產生一定毒性(楊愛國等,1999;陳松林等,2007)。

本實驗通過對 GLY、PG、DMSO、EG、MeTH五種抗凍劑的篩選發現:稀釋液加蛋黃的 12%PG為抗凍劑,通過分步降溫法超低溫凍存的太平洋鱈精子在解凍后精子運動率最高;添加蛋黃的12%DMSO為抗凍劑,通過分步降溫超低溫保存的太平洋鱈精子其精子運動速率最快。Butts等人(2010)在大西洋鱈精液冷凍過程中發現10%的PG對大西洋鱈精子冷凍效果最好,解凍后精子運動率最高;DeGraaf等(2004)冷凍保存黑線鱈(Melanogrammus aeglefinus)、大西洋鱈精子時發現PG對這兩種鱈魚精子冷凍保存效果最好。分類地位相近的魚類,其精子大小、結構和組成成分都很相似,所以其在冷凍保存中會有很多共同之處,可以相互借鑒。本實驗借鑒了與太平洋鱈同屬的大西洋鱈、狹鱈(Theragra chalcogrammaPallas)、黑線鱈等成熟的冷凍方法(Rideoutet al,2004),得到了與這幾種鱈魚相近的結果。從實驗結果可以看出,12%PG作為保護劑的精子具有最高的激活率,而12%DMSO作為抗凍劑對保持精子的運動速率有一定作用。12%PG和 12%DMSO作為抗凍劑,是兩種滲透性的小分子物質,滲透速度快,其主要作用是滲入精子細胞內部,發生水合作用結合水分子,使溶液的黏性增加,弱化水的結晶過程,以保護精子不受冷凍損傷。其使用的濃度、滲入細胞的能力、對水分子活性的影響各不相同。12%PG和12%DMSO在太平洋鱈的冷凍過程中,能夠有效地沖淡溶質的濃度,降低冰點,防止大冰晶的產生,以避免冷凍和解凍過程中細胞腫脹死亡。

3.3 抗凍劑種類和濃度對精子運動速度的影響

精子的運動率與卵子的受精率存在一定的相關性,精子運動速率是評價精子質量的一個重要的指標,采用CASA檢測精子質量的方法已廣泛應用于受精生物學的研究中(柳凌等,2007),CASA主要用于分析精子激活后精子平均直線速度、平均曲線速度、平均路徑速度等指標,能夠方便、快捷的統計分析精子運動狀態,以評價精子質量(Liuet al,2007;Daiet al,2012)。實驗采用 CASA檢測新鮮和凍融后太平洋鱈精子發現,凍存精子的運動速度大部分低于新鮮精子,但亦有個別實驗組凍融后精子速度明顯高于鮮精。Butts等(2011)在冷凍大西洋鱈魚精子發現,冷凍過程中質量差的精子被凍死,質量好的精子存活了下來,精子冷凍保存提高了精子的質量。由于CASA分析的是視野中所有精子的平均運動速率,因此,本實驗中,由于活力差、運動速率慢的精子死亡,存活下來的精子質量提高導致了精子平均運動速度的提高。精子的運動主要是由鞭毛系統控制的,鞭毛含有ATP酶,提供了精子運動的動力,誘導精子運動主要與離子濃度、pH和滲透壓有關。太平洋鱈精子冷凍過程中發現部分鞭毛結構受損,導致主要起動力作用的雙聯微管的結構受損,最終導致運動速率的下降,抗凍劑種類和濃度的不同,對精子鞭毛結構的保護作用不同造成了解凍后精子運動速率的差異。

3.4 太平洋鱈鮮精及凍精的超微結構

在超低溫冷凍保存過程中因溫度的急劇變化使精子易受冰晶的損傷,影響凍融精子運動率。在一些魚類精子超低溫冷凍保存的研究中發現,精子超微結構的變化主要表現為生理特性的變化(Billard,1983;Chenet al,2010)與結構的損傷(汪小鋒等,2003;)。本研究超低溫保存太平洋鱈精子表明:超低溫冷凍細胞膜、線粒體和鞭毛均造成不同程度的破壞,具體包括細胞膜破裂,線粒體脫落、變形,鞭毛斷裂等,與其他學者在冷凍保存其他物種精子時造成的結構損傷基本一致。例如有研究顯示,低溫冷凍對精子結構產生了明顯的損害(程順等,2013),較為常見的精子形態異常現象變化包括:精子質膜的變化,如膨脹或破損;核的變化,如核膜消失,染色質解體,DNA損傷(Cabritaet al,2005;Junet al,2006;魏平等,2010);細胞器的損傷,如線粒體膨脹破損、軸絲斷裂(王小剛等,2013)。太平洋鱈精子冷凍過程中細胞膜的損傷,破壞了精子正常的生理結構,導致精子功能紊亂,這與章龍珍等(2008)冷凍鱘魚過程中造成膜蛋白脫落,導致細胞內環境改變,精子細胞膜發生膜脂晶格化,使精子細胞功能紊亂,進而影響精子活力和受精率孵化率的結果相一致。線粒體和鞭毛在精子運動過程中起著重要作用,線粒體提供能量,促使鞭毛擺動(楊愛國等,1999)。精子激活后,精子依靠尾部鞭毛的擺動而運動。在超低溫冷凍太平洋鱈精子時發現,鞭毛結構發生了不同程度的損傷多發生于中段,如鞭毛破裂、折斷、打結、皺縮等。本研究認為,超低溫冷凍和升溫過程中,由于精細胞鞭毛中段結合處膜結構比較脆弱,在冷凍過程中易受到損傷,超低溫冷凍、解凍過程容易導致該段受到損傷,這與凍精掃描電鏡鞭毛損傷、盤繞、折斷多發生于中段相一致。精子鞭毛結構的損傷最終導致精子細胞運動速率的下降,進而影響了卵子的受精率。

目前,人們對精子冷凍損傷機制的本質尚未了解透徹,精子的低溫損傷機制需要更深入的研究,電子顯微鏡在精子超低溫保存技術中的應用,推動了精子超低溫冷凍損傷的研究。

本研究結果建立了太平洋鱈精子冷凍的方法;對解凍后精子質量進行了全面細致的分析;并且第一次詳細描述了冷凍保存對太平洋鱈精子超微結構的影響。這一研究將有助于太平洋鱈以及其他鱈魚冷凍保存技術的完善與提高。

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