高效液相色譜法檢測雞肉中替米考星藥物殘留的檢測與分析

曹忠君

（遼寧省鐵嶺市畜產(chǎn)品安全檢測站，遼寧 鐵嶺 112000）

高效液相色譜法檢測雞肉中替米考星藥物殘留的檢測與分析

曹忠君

（遼寧省鐵嶺市畜產(chǎn)品安全檢測站，遼寧 鐵嶺 112000）

本研究應(yīng)用高效液相色譜法對來自市場中64批次雞肉樣品進(jìn)行替米考星藥物殘留的檢測。結(jié)果表明，替米考星藥物殘留物在雞肉中的平均回收率為70.5%～92.3%。顯示該方法具有靈敏、快速的特點(diǎn)，符合現(xiàn)行獸藥殘留分析的要求。替米考星藥物殘留有一定檢出率，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管。

替米考星；雞肉；高效液相色譜法

替米考星（ti lmicosin，TIL）屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（macrol ide antibiotics，MALs），其分子式為C46H80N2O13，分子量為869.15。英國Elanco動(dòng)物保健品公司在20世紀(jì)80年代開發(fā)成功。在巴西、馬來西亞、澳大利亞、法國、美國、西班牙等國家被批準(zhǔn)用于獸醫(yī)臨床。現(xiàn)已通過了我國農(nóng)業(yè)部獸藥評審委員會(huì)的嚴(yán)格審核，獲得國家三類新獸藥證書和批準(zhǔn)文號[1]。替米考星為中譜抗生素，其特征是抗革蘭氏陽性菌活性、抗支原體活性和低毒性，在雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中，用于預(yù)防和治療支原體病等。其危害是損害前庭和耳蝸神經(jīng)，導(dǎo)致眩暈和聽力減退。藥物在體內(nèi)蓄積達(dá)到一定的濃度，可造成肝腎的嚴(yán)重?fù)p害[2]。Kohanski等[3]通過試驗(yàn)證明，亞劑量的抗生素會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生基因突變，從而發(fā)生單重或者多重耐藥性。雞肉中若存在亞劑量的抗生素，可利用選擇壓力方式，導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生突變，從而使其獲得抵御抗生素的能力。如果食用者食用含有耐藥菌株的雞肉后，有可能會(huì)發(fā)生耐藥菌株在體內(nèi)蓄積，倘若耐藥菌株把耐藥基因利用基因交換傳播給體內(nèi)的致病細(xì)菌，結(jié)果會(huì)使人體誘發(fā)嚴(yán)重疾病。我國農(nóng)業(yè)部于2002年12月24日發(fā)布了第235號公告，對動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量予以規(guī)定。其中，規(guī)定替米考星在雞肉中的最高殘留限量不得超過75μg/kg。

目前常用的測定動(dòng)物性食品中替米考星及其活性代謝物殘留量的方法主要有酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析法、高效液相色譜法和紫外分光光度計(jì)法等。高效液相色譜法具有高效、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最普遍的一種方法。

本研究旨在驗(yàn)證高效液相色譜法檢測雞肉中替米考星藥物殘留的可行性，也為了了解、調(diào)查某城市市場中流通雞肉替米考星藥物殘留的實(shí)際情況，為相關(guān)部門預(yù)防和治理食品安全問題提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備美國WATERS公司2695型高效液相色譜儀，配有2998二極管陣列檢測器；飛利浦公司HR2168型絞肉機(jī)；HITACHI公司CF160RXⅡ立式高速冷凍離心機(jī)；北京天平物華醫(yī)療儀器有限責(zé)任公司DT-200電子天平（感量0.01 g）；賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司CP225D型電子分析天平（感量：0.000 01 g）；德國IKA（廣州）儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司MS3(基本型)蝸旋混合器；昆山市超聲儀器有限公司KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器；天津市恒奧科技發(fā)展有限公司Type HSC-24A型24孔水浴加熱氮吹儀，連接純度99.9%以上氮?dú)猓唤K省金檀國華儀器廠HY-4型振蕩器；美國奧康公司24孔固相萃取裝置；Agela Technologies公司Cleaner t C18-SPE（500 mg/6 mL）固相萃取柱；Discovery C18（25 cm×4.6 mm，5μm）色譜柱；Thermo公司移液器（50μL、300μL、1 mL、10 mL 4種規(guī)格）。

1.2 試劑和材料替米考星（ti lmicosin，TIL）標(biāo)準(zhǔn)品（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），色譜純乙腈（Fisher公司），色譜純甲醇（Fisher公司），水為二次蒸餾水，磷酸二氫鉀，乙酸，乙酸銨，50 mL、100 mL規(guī)格聚乙烯離心管，0.5μm有機(jī)相微孔濾膜。

64批次雞肉樣品，分別于2013年下半年至2014年上半年不同時(shí)期在多個(gè)市場隨機(jī)抽取。樣品編號為：CM/CL001～CM/CL064。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品和溶液的配置 應(yīng)用感量為0.000 01 g的電子天平精確稱量替米考星約0.002 00 g，用乙腈稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，其濃度為：20μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存在2～8℃的冰箱中，有效期為3個(gè)月。應(yīng)用移液器精確吸取5.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋定溶至10 mL容量瓶中，使其濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

磷酸二氫鉀緩沖液：稱取13.61 g磷酸二氫鉀溶解于800 mL蒸餾水中，用磷酸調(diào)pH至2.5，再用蒸餾水稀釋至1 000 mL；0.1 mol/L乙酸銨緩沖液（pH：5.0）：稱取38.55 g乙酸銨，用蒸餾水溶解定容至1 000 mL，再用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.0±0.2。

洗脫液（0.1 mol/L乙酸銨甲醇-乙腈，20+80，V/V）：稱取7.71 g乙酸銨溶解于200 mL甲醇中，加790 mL乙腈混勻，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至1 000 mL[4]。

1.3.2 樣品處理及提取 應(yīng)用絞肉機(jī)將約500 g雞肉樣品全部充分絞碎，量取5.0±0.05 g肉樣至50 mL聚乙烯離心管中，同法另取空白樣品兩份，其中一份空白樣品添加替米考星標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)離心管中加乙腈5.0 mL，應(yīng)用蝸旋混合器將樣品充分混勻1 min，超聲波清洗器超聲3 min，振蕩器中速振蕩5 min，10 000 r/min離心10 min，收集上清液于100 mL離心管中。組織殘?jiān)僖来渭尤? mL磷酸二氫鉀緩沖液和乙腈，應(yīng)用蝸旋混合器將樣品充分混勻3 min，振蕩器中速振蕩10 min，10 000 r/ min離心10 min，合并2次上清液，加水30 mL充分混勻待凈化。

Cleaner t C18-SPE（500 mg/6 mL）固相萃取柱首先依次用甲醇、水各10 mL活化，上清液全部過柱，依次用10 mL水和乙腈淋洗，擠干。然后用洗脫液3.0 mL洗脫，擠干，收集洗脫液。將收集好的洗脫液于加熱至30℃的氮吹儀吹干。用1 mL流動(dòng)相將吹干物復(fù)溶，充分渦旋1 min，最后經(jīng)0.5μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，裝瓶待上機(jī)。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：Discovery C18（25 cm× 4.6 mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相：0.1 mol/L乙酸胺緩沖液（乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.0±0.2）-乙腈-甲醇=（60+ 30+10，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30± 5℃；進(jìn)樣體積：50μL；檢測波長：290 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 計(jì)算公式

式中：X-樣品中替米考星殘留量（μg/kg），Ai-樣品溶液中替米考星的峰面積，C-標(biāo)準(zhǔn)工作液中替米考星的濃度（μg/mL），V-試樣定容體積（mL），f-樣品稀釋倍數(shù)，As-兩個(gè)平行標(biāo)準(zhǔn)工作液中替米考星峰面積的平均值，M-樣品的質(zhì)量（g）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

圖1 替米考星標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram of tilm icosin standards

由圖1可以看出，替米考星組份的保留時(shí)間為14.518 min，其色譜峰分離完全，峰型狹窄、對稱，無拖尾、分叉、前沿現(xiàn)象。說明色譜條件良好，流動(dòng)相配比適中，色譜柱效能高，標(biāo)準(zhǔn)品有效未分解。

2.3 方法回收率、精密度、批內(nèi)批間重復(fù)性和檢出限 回收率（RC）公式為：RC=空白添加樣品測定值/空白添加樣品添加值×100%。每次試驗(yàn)附加1批次空白樣品和1批次空白添加樣品（添加量為已知），見圖2、圖3對照比較，其替米考星組分的保留時(shí)間為14.628 min。在相同條件下連續(xù)平行測定5次，根據(jù)5次結(jié)果計(jì)算相對偏差。結(jié)果見表1，另測定不同來源的4批次陰性雞肉樣品的加標(biāo)回收率。每個(gè)樣品平行測定5次，各個(gè)批次平均加標(biāo)回收率均在70.5%～92.3%，批內(nèi)和批間的相對偏差見表1，回收率最大相對偏差小于10.0%。以3倍信噪比（S/N）計(jì)算，該方法的檢出限為10μg/kg。

圖2 空白添加替米考星高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of tilm icosin of recoveries

表1 數(shù)據(jù)分析表Tab le1 Data ana lysis table

圖3 空白樣品高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chrom atogram o f the blank sam ple

2.4 樣品結(jié)果分析見表2。

表2 雞肉中替米考星藥物殘留情況Tab le2 Tilm icosin residues in chicken

從表2可以看出，64批次雞肉樣品共有5批次檢出有替米考星藥物殘留，檢出率7.8%。在檢出的5批次樣品中含量均未超過我國農(nóng)業(yè)部第235號公告中對該類藥物最高殘留限量為75μg/kg的限量值。

3 討論與結(jié)論

通過對64批次雞肉樣品中替米考星藥物的檢測可以看出，應(yīng)用高效液相色譜法檢測替米考星藥物靈敏、高效、準(zhǔn)確，便于批量檢驗(yàn)。7.8%的高檢出率表明此類藥物在肉雞養(yǎng)殖中應(yīng)用普遍。有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對肉雞中抗生素殘留的監(jiān)測。5批次被檢出樣品均未超標(biāo)，說明待宰動(dòng)物都執(zhí)行了休藥期的規(guī)定。但是，低濃度的抗生素殘留會(huì)很大程度上影響肉品質(zhì)，也將會(huì)引發(fā)更多的抗藥基因問題，對人類健康及生態(tài)環(huán)境造成潛在威脅。所以，有關(guān)部門應(yīng)指導(dǎo)合理使用抗生素，嚴(yán)格控制動(dòng)物使用抗生素的休藥期，不定期監(jiān)督抽樣檢測替米考星等抗生素的殘留量。

[1]王煊，馬志強(qiáng)，王忠仁.動(dòng)物專用抗菌藥—替米考星的簡介[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2012，（4）：241.

[2]劉勇軍.固相萃取-高效液相色譜法測定豬肉與雞肉中替米考星、泰樂菌素殘留量[J].肉類研究，2012，（12）：26.

[3]KOHANSKIMA，dePRISTO M A，COLLINSJJ.Sublethalantibiotic t reatment leads to mul tidrug resistance via radical-induced mutagenesis[J]. MolecularCel l，2010，37（3）：311-320.

[4]農(nóng)業(yè)部1025號公告-10-2008.

（編輯：郭雪峰）

Determ ination and Analysis of tilm icosin Drug residue in chicken by HPLC

Cao Zhongjun
（Tieling Livestock Product Safety Inspection Station，Liaoning Tiel ing 11200）

Ti lmicosin drug residue were tested f rom 64 chicken samples col lected f rom urban areas using HPLC method.The resul ts showed that recoveries for each analyte in chicken ranged f rom 70.5%～92.3%.This method is fast and sensitive,and can be used to simul taneously analyze residual of quinolones in actual samples.There is a relevance ratio of ti lmicosin residue,therefore Authorities should take it seriously.

Ti lmicosin;Chicken;HPLC

S859.84

：B

：1672-9692(2014)10-0013-04

2014-08-28

曹忠君（1979-），男，碩士，畜牧師，主要從事畜產(chǎn)品獸藥殘留檢測工作。