10株雞源奇異變形桿菌的質粒消除及耐藥性研究

蘇葳藝，李欣南，韓鐫竹

（遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016）

10株雞源奇異變形桿菌的質粒消除及耐藥性研究

蘇葳藝，李欣南，韓鐫竹

（遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016）

為建立SDS消除奇異變形桿菌質粒的方法，了解奇異變形桿菌的質粒與奇異變形桿菌耐藥性表型之間的關系，采用正交設計的試驗方法研究奇異變形桿菌的消除條件，并采用瓊脂糖凝膠電泳的方法進行驗證，篩選出質粒消除效果最佳的試驗條件。采用微量稀釋法進行質粒消除前后奇異變形桿菌對13種抗生素的藥敏性測定。結果顯示，消除效果最好的條件為消除劑SDS濃度0.2%，溫度42℃，消除72 h。將該組消除后不含質粒的奇異變形桿菌與原含質粒奇異變形桿進行耐藥性試驗，結果表明，10株雞源奇異變形桿菌消除質粒后，其中9株對頭孢噻呋的藥物敏感性由耐藥變為敏感。

奇異變形桿菌；質粒消除；耐藥性

奇異變形桿菌（Proteus mirabi l is）屬于變形桿菌屬（proteus），廣泛存在于泥土、水和糞便污染的物質中，可引起食物中毒、泌尿系感染等，近年來由奇異變形桿菌引起的食物中毒事件較多[1-6]。雞奇異變形桿菌病（Proteus mirabi l is disease）是近年來國內新發現的一種急性熱性細菌性傳染病[7-8]。該病的特征是食欲下降、翅膀下垂、咳嗽、體溫升高、腹瀉。病雞主要表現為菌血癥、敗血癥，各代，從而造成雛雞的大批死亡。臨床數據表明該病的發病率和死亡率均較高[9]。隨著廣譜抗生素特別是頭孢菌素的大量應用，臨床耐藥菌株的產生日益嚴重，其耐藥性也在不斷增加，給臨床抗感染治療帶來極大的困難[10]。

種日齡的雞群都可感染本病，但以7周齡以下的雛雞最易感，種雞感染本病后可通過種蛋傳給后

細菌的耐藥性可由染色體遺傳基因介導或質粒攜帶的基因介導產生。隨著細菌耐藥性形成機制研究的深入，獨立于細菌染色體以外的遺傳物質——質粒所編碼的耐藥性越來越受到重視[11]。本試驗通過正交試驗的方法來研究奇異變形桿菌的質粒消除條件，篩選出質粒消除的最佳試驗條件，并考察質粒消除對試驗奇異變形桿菌耐藥表型的影響。

本試驗通過正交設計的方法來研究奇異變形桿菌的質粒消除條件，篩選出質粒消除的最佳試驗條件，將質粒消除前后的菌株進行耐藥性試驗，通過比較兩組耐藥性結果來證明質粒對奇異變形桿菌耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器生物安全柜（美國NUAIRE）；全自動高壓滅菌器（日本三洋）；電熱恒溫培養箱（MEMMERT）；DENSIMAT麥氏比濁儀（梅里埃）；ABT Expression鑒定儀（梅里埃）；HITACHI CF16RX離心機（日立）；BIO-RAD紫外凝膠成像系統（美國伯樂）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 試劑與材料TIAN GEN快速質粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司）；ID32E鑒定條（梅里埃）；凍干型動物源細菌藥敏檢測板（天津金章）；甘油（國藥）；SDS（國藥）；TBE Buf fer.（北京普利來技術有限公司）；Loading Buf fer（大連寶生物）；Marker DL1000、Marker DL2000（大連寶生物）；Agarose Regular瓊脂糖（大連寶生物）；營養瓊脂培養基（北京陸橋技術有限公司）；LB肉湯培養基（杭州微生物試劑有限公司）；營養肉湯培養基（青島高科園海博生物有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的活化 取菌種保藏管中的試驗菌株100μL于10 mL營養肉湯中37℃培養24 h，劃線接種于營養瓊脂平板，37℃倒置培養24 h，備用。

1.3.2 奇異變形桿菌的鑒定 采用棉簽取1.3.1新鮮培養的單菌落于生理鹽水中，濁度調至0.5麥氏，然后吸取菌液到ID32E鑒定條按照鑒定條說明進行操作，37℃培養24 h，然后放入ABT Expression鑒定儀（梅里埃）中做生化鑒定。

1.3.3 藥物敏感性測定（微量稀釋法） 采用含有13種抗生素的腸道桿菌96孔凍干藥敏板進行藥敏試驗。用棉簽取培養好的單菌落于3 mL生理鹽水培養瓶中，放到麥氏比濁儀中調菌濃至0.5麥氏，吸取100μL菌液于10 mL MH肉湯培養液的平皿中，搖勻，反復吸打幾次，然后吸取100μL菌液依次加入到96孔耐藥板中，右下角一個空加入100μL肉湯培養液作為空白對照，最后蓋好蓋子放入培養箱中37℃培養24 h。24 h后取出藥敏板，打開蓋子，放在鏡子上觀察，透明的為陰性反應（-）即菌體未生長，有渾濁菌液的為陽性反應（+）。

1.3.4 奇異變形桿菌的質粒提取 用TIAN GEN快速質粒小提試劑盒提取10株奇異變形桿菌的質粒，按照試劑盒說明書進行提取，然后將提取的質粒進行瓊脂糖凝膠電泳，進行后續試驗。

1.3.5 奇異變形桿菌SDS質粒的消除的正交試驗以消除時間、消除溫度和消除劑濃度作為考察因素，設計出9種不同的條件進行考察。通過文獻查閱和預試驗確定SDS濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%，因素水平表見表1～2。

表1 奇異變形桿菌質粒消除影響因素水平表Table1 For singular proteus plasm id elim inate the factors affecting the inspection tab le

表2 奇異變形桿菌消除正交試驗設計表Table2 singular proteus elim inates orthogonal experimental design

將含質粒奇異變形桿菌的新鮮培養物接種于10 mL LB肉湯的試管中，37℃振蕩培養24 h。依表1配置不同濃度的SDS LB肉湯，分裝，120℃高壓滅菌15 min。依表2分別加入新鮮LB肉湯培養物10μL，在不同條件下進行質粒消除試驗。消除后進行平板培養獲得質粒消除菌株。依照1.2.4進行質粒提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。電泳條件為：濃度電泳1%、電泳電壓127 V、電泳時間37 min。

1.3.6 消除質粒前后藥敏結果比較 采用微量稀釋法分別測定消除質粒前后同一株奇異變形桿菌的藥敏敏感性，并將結果進行比較和分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定對1010株菌株進行生化鑒定采用梅里埃半自動細菌鑒定儀對菌株進行鑒定，以生化鑒定作為最終判定標準。結果10株菌的生化譜顯示均為奇異變形桿菌。表3為奇異變形桿菌生化鑒定譜。

2.2 奇異變形桿菌的質粒提取用TIAN GEN快速質粒小提試劑盒提取10株奇異變形桿菌的質粒，并做瓊脂糖凝膠電泳試驗檢驗質粒是否提取到，結果10株奇異變形桿菌均含有質粒，重復質粒提取試驗，結果一致，見圖1。

圖1 奇異桿菌質粒消除前，提取質粒的電泳圖譜Fig.1 Be fore singular coli plasm id elim ination,the extraction o f plasm id e lectrophoresis

2.3 含質粒奇異變形桿菌質粒的消除通過正交試驗篩選奇異變形桿菌最佳質粒消除條件為：消除劑SDS濃度為0.2%，消除溫度42℃，消除時間72 h，電泳圖見圖2。

2.4 質粒消除前后奇異變形桿菌的藥物結果比較質粒消除前后藥敏結果比較如圖3所示，頭孢噻呋的耐藥性在質粒消除前后變化較大，由消除前的100%耐藥變為消除后僅有10%耐藥。阿莫西林的耐藥性由50%增加到70%，而慶大霉素的耐藥性由70%增加到80%。

表3 奇異變形桿菌生化鑒定譜Table3 Proteus m irabilis biochem ical spectrum

圖2 消除時間72 h，消除溫度42℃，消除劑SDS濃度為0.2%的質粒提取電泳圖譜Fig.2 To elim inate tim e 72 hours,e lim inate 42℃ tem perature,elim inate the SDS concentration of 0.2%of p lasm id extraction and electrophoresis

圖3 奇異變形桿菌質粒消除前后對13種抗生素的耐藥率柱狀圖Fig.3 The singular proteus plasm id elim ination of 13 kinds of antibiotic resistant rate before and after the histogram

3 討論

通過控制變量的方法對質粒消除的條件進行研究，發現在消除劑SDS濃度為0.2%、消除溫度42℃、消除時間72 h時，消除效果最佳。龍海英等[12]報道大腸埃希菌的SDS消除濃度為0.05%，說明不同菌種的消除條件有著較大差異。

根據奇異變形桿菌質粒消除前后藥敏結果的比較發現，頭孢噻呋的耐藥性在質粒消除前后變化較大，由消除前的10株全部耐藥變為消除后僅有1株耐藥9株敏感，說明奇異變形桿菌所含頭孢噻呋耐藥基因部分由質粒介導，這一結果與Yuj i Watanabe[13]報道變形桿菌所含頭孢呋新耐藥基因部分由質粒介導的試驗結果一致，說明奇異變形桿菌的二代、三代頭孢類耐藥基因可能均系質粒介導。本試驗結果未發現質粒消除前后氨芐西林和四環素耐藥性發生明顯變化，可以推斷氨芐西林和四環素的主要耐藥機制可能不在質粒上。試驗發現質粒消除后阿莫西林的耐藥性和慶大霉素的耐藥性發生微量的變化，但整體耐藥性消除前后變化不大。說明奇異變形桿菌對試驗的其他12種抗生素的主要耐藥機制比較復雜。

由于獸醫臨床用藥的不規范和飼養環節長期低劑量使用抗生素，造成細菌耐藥越來越嚴重，耐藥機制越來越復雜，嚴重影響了養殖業的健康發展。因此，臨床主要抗生素的耐藥機制研究，對于控制細菌耐藥性的蔓延具有重要意義。

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（編輯：張婷婷）

Drug-resistance research and elim ination of drug resistance p lasm ids of 10 strains of chicken source Proteusm irabilis

Su Weiyi,Li Xinnan,Han Juanzhu
(Liaoning province of veterinary feed quality and safety of animal products testing center,Liaoning Shenyang 110016)

To establ ish a SDS method for el iminating Proteus mirabi l is plasmid,understanding the relationship between plasmid and Proteus Baci l lus drug resistance phenotype.To study the el imination conditions of the Proteus mirabi lis using experimental orthogonal method,veri fied the methods with agarose gel elect rophoresis,screened the best experiment conditions to el iminated the plasmid.Proteus drug sensitivity to 13 antibiotics was determined by microdilution method, then plasmid were el iminated.The resul ts showed the best ef fective el iminate tconditions was agent concent ration of SDS 0.2%,temperature 42℃,lasted for 72 hours.Then drug-resistance tests were took place to detect the susceptibil ity of Proteus with and without plasma.The resul ts showed that,10 drug-resistance st rains of chicken source Proteus when el iminated plasmid,9 st rains were sensitive to cef tiofur.

Proteus mirabi l is;Plasmid el imination;Drug resistance

S852.61

：B

：1672-9692(2014)10-0005-05

2014-09-22

蘇葳藝（1987-）男，本科，研究方向為畜產品質量安全。