蘿卜硫素對饑餓誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡的抑制作用

鄭來雙，馬玉蓮（河南省醫藥采購服務中心，鄭州 450000）

血管內皮細胞（Vascular endothelial cell，VEC）遍布全身，是覆蓋于整個心血管系統表面的一層扁平細胞，為維持血液循環系統的健康發揮著至關重要的作用[1]。在正常情況下，VEC 與血液直接接觸，處于營養充足狀態。而在缺血饑餓狀態下，VEC 會快速走向凋亡[2]。VEC 凋亡會直接威脅機體平衡，導致動脈粥樣硬化、敗血癥休克等[3]。如何防治VEC凋亡，已成為近年來研究的熱點[4-5]。

蘿卜硫素（Sulforaphane）是迄今為止蔬菜中發現的抗癌活性最強的一類異硫代氰酸鹽[6]，并具有抗氧化功能[7]。有文獻報道，蘿卜硫素可以有效地抑制氧化低密度脂蛋白引起的內皮細胞損傷[8]，以及脂多糖誘導的內皮細胞的炎癥反應[9]。但是，蘿卜硫素對饑餓誘導VEC 凋亡的影響則少見報道。為此，筆者初步探究蘿卜硫素抑制饑餓誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）凋亡的作用，以期為臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

CO2培養箱（美國Thermo Fishier 公司）；X35型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Elx800型酶標儀（美國Bio Tek公司）。

1.2 藥品與試劑

M199完全培養基（美國Invitrogen公司）；重組牛堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，珠海東大生物制藥有限公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；蘿卜硫素、二甲亞砜（DMSO）、磺酰羅丹明B（SRB）、Hoechst 33258、吖啶橙（美國Sigma公司）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；微管相關蛋白輕鏈3（LC3）抗體（美國Cell signaling technology 公司）；GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（美國Santa Cruz 公司）；PVDF膜、超敏化學發光底物（美國Millipore公司）。

1.3 細胞

HUVECs購于中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養與分組

HUVECs在M199完全培養基中常規培養，完全培養基中含有10%胎牛血清、2μmol/ml的bFGF。培養條件為飽和濕度下37℃、5%CO2。HUVECs隨機均分為4組，即正常對照（完全培養液）組、模型（模型培養液）組與蘿卜硫素高、低濃度（10、5μmol/L）組。

2.2 顯微鏡觀察細胞形態

將HUVECs種植到24孔板中，處理完畢后，利用顯微鏡拍照并分析細胞形態變化。

2.3 SRB 法檢測細胞存活率

將HUVECs種植到96孔板中，空白組僅細胞培養液（不含細胞）；正常對照組、模型組與蘿卜硫素高、低濃度組給藥同“2.2”項下方法。加藥處理6、12、24h 后，棄去舊培養液，每孔加入100μl 10%三氯乙酸（TCA），4℃下固定1h；去離子水輕輕沖洗5次，室溫下自然晾干；每孔加入50μl 0.4%的SRB，室溫染色5min（平板震蕩）；棄染液，1%乙酸洗5次，風干；每孔加100μl 10mmol/L Trisbase 液，在平板震蕩器上震蕩5min。將空白組調零，用酶標儀于540nm 波長處檢測各樣品的光密度（OD），計算細胞存活率。細胞存活率＝（給藥組OD/模型組OD）×100%。正常對照組存活率設置為100%。

2.4 Hoechst 33258染色法檢測細胞凋亡程度[10]

分組與給藥同“2.1”項下方法。將HUVECs 種植到24孔板中，藥物處理完畢后利用Hoechst 33258染色法對細胞進行活細胞染色。棄24孔板中細胞培養液，用PBS輕輕沖洗細胞1次；每孔加入0.5ml Hoechst 33258染液（10μg/ml），包上鋁泊放入CO2培養箱中孵育15min；棄24孔板中染液，用PBS輕輕沖洗細胞2次；在顯微鏡下觀察、拍照，紫外光激發，發射光為藍色。Hoechst 33258染色顯示細胞核片段化的細胞為凋亡細胞。

2.5 吖啶橙染色檢測細胞自噬水平（酸性膜泡積累）變化[11]

分組與給藥同“2.1”項下方法。將HUVECs 種植到24孔板中，化合物處理24h 后吸棄各孔中培養液，PBS 沖洗細胞2次；每孔中加入3滴吖啶橙染液（0.1mg/ml），染色1min；用PBS沖洗細胞2次；吸干PBS，再加入2滴新1×PBS（保持孔底濕潤），顯微鏡下觀察；用藍色熒光激發，綠色為細胞核，紅色即為酸性膜泡，拍照記錄。吖啶橙染色顯示的酸性膜泡積累情況是檢測細胞自噬水平的重要指標。

2.6 Western blot法檢測細胞自噬水平（自噬標志蛋白LC3蛋白表達）變化[11]

分組與給藥同“2.1”項下方法。將HUVECs 種植到10cm培養皿中，藥物處理24h 后利用RIPA 裂解液收集全蛋白，20μl 上樣量進行電泳，按常規轉膜，封閉后加一抗（1∶2000，V/V）4℃過夜，PBS漂洗3遍加二抗（1∶5000，V/V）室溫1h，ECL顯色，拍照記錄。LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值與自噬水平正相關。

2.7 統計學方法

至少取3次獨立試驗的結果，進行One-way ANOVA 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 蘿卜硫素對模型細胞形態的影響

與正常對照組比較，模型組HUVECs出現細胞邊緣發亮，脫離皿底的現象隨著時間延長而愈加明顯；同時，高、低濃度蘿卜硫素可以有效地抑制這種現象。蘿卜硫素對模型細胞形態的影響見圖1。

3.2 蘿卜硫素對模型細胞存活率的影響

與正常對照組比較，培養12、24h 時，模型組HUVECs 存活率降低，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組比較，培養12、24h時，蘿卜硫素高、低濃度組HUVECs存活率升高，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。蘿卜硫素對模型細胞存活率的影響見表1。

3.3 蘿卜硫素對模型細胞凋亡程度的影響

與正常對照組比較，培養12、24h 時，模型組HUVECs 細胞核皺縮現象增多；同時，高、低濃度蘿卜硫素可以明顯抑制細胞核皺縮現象。蘿卜硫素對模型細胞凋亡程度的影響見圖2、表2。

3.4 蘿卜硫素對模型細胞自噬水平（酸性膜泡積累）的影響

圖1 蘿卜硫素對模型細胞形態學的影響Fig 1 Effects of sulforaphen on the morphology of model cell

表1 蘿卜硫素對模型細胞存活率的影響（n＝6）Tab 1 Effects of sulforaphen on survival rate of model cell（n＝6）

圖2 蘿卜硫素對模型細胞凋亡程度的影響（Heochst 33258染色）Fig 2 Effects of sulforaphen on the apoptosis of model cell（Heochst 33258staining）

表2 蘿卜硫素對模型細胞凋亡程度的影響（n＝6）Tab 2 Effects of sulforaphen on the apoptosis of model cell（n＝6）

與正常對照組比較，模型組HUVECs 中酸性膜泡明顯增多；同時，高、低濃度蘿卜硫素可以進一步促進細胞中酸性膜泡的積累。結果表明，蘿卜硫素可能引起HUVECs 自噬。蘿卜硫素對模型細胞自噬水平的影響見圖3。

圖3 蘿卜硫素對模型細胞自噬水平的影響（吖啶橙染色）Fig 3 Effects of sulforaphen on model cell autophagy（acridine orange staining）

3.5 蘿卜硫素對模型細胞LC3蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組HUVECs中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達增強，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，蘿卜硫素高、低濃度組HUVECs中LC3-Ⅱ蛋白表達進一步增強，差異具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），且蘿卜硫素高濃度組HU-VECs中LC3-Ⅰ表達進一步增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，在饑餓條件下，蘿卜硫素可以有效地誘導HUVEC自噬。蘿卜硫素對模型細胞LC3蛋白表達的影響見表3。

表3 蘿卜硫素對模型細胞LC3表達的影響（n＝6）Tab 3 Effects of ulforaphen on the expression of LC3in model cell（n＝6）

4 討論

由于近年來對VEC 生物學功能認識的不斷深入，發現其在多種人類疾病發病機制中起重要作用。有研究表明，VEC凋亡導致血管內皮層防止脂質沉積的屏障作用減弱，加速粥樣斑塊的形成[12]，又可以啟動凝血機制在病變局部形成血栓，加重血管管腔狹窄[13]。因此，抑制VEC 凋亡具有重要的臨床意義。有研究表明，自噬可以抑制氧脅迫、代謝壓力以及炎性因子誘導的VEC 凋亡。因此，通過調節自噬的水平抑制VEC的凋亡可以作為保護內皮的一種新思路。

作為一種植物抗癌物質，蘿卜硫素能夠刺激人或動物細胞產生僅對身體有益的Ⅱ型酶，同時抑制Ⅰ型酶的產生，使細胞形成對抗外來致癌物浸蝕的膜，達到抗癌效果[13]。有關蘿卜硫素的臨床報道很多，但是在VEC 保護方面的作用還知之甚少。在本研究中，筆者發現蘿卜硫素可以有效地抑制由饑餓引起的HUVECs 存活率降低和凋亡，此外還可以誘導HUVECs自噬。由此推斷，蘿卜硫素可能通過誘導HUVEC自噬，抑制饑餓引起的細胞凋亡，進而提高其存活率。然而，蘿卜硫素調控HUVECs自噬的具體機制仍需進一步的研究。

綜上，本研究初步探討了蘿卜硫素在VEC 保護中的潛在價值，為蘿卜硫素的臨床應用以及VEC 自噬分子機制的研究提供了一個新的切入點。

[1]Esper RJ，Nordaby RA，Vilari?o JO，et al.Endothelial dysfunction：a comprehensive appraisal[J].Cardiovasc Diabetol，2006（23）：5.

[2]Russell FD，Hamilton KD.Nutrient deprivation increases vulnerability of endothelial cells to proinflammatory insults[J].Free Radic Biol Med，2014（67）：408.

[3]Sima AV，Stancu CS，Simionescu M.Vascular endothelium in atherosclerosis[J].Cell Tissue Res，2009，335（1）：191.

[4]Mudau M，Genis A，Lochner A，et al.Endothelial dysfunction：the early predictor of atherosclerosis[J].Cardiovasc J Afr，2012，23（4）：222.

[5]Jain MV，Paczulla AM，Klonisch T，et al.Interconnections between apoptotic，autophagic and necrotic pathways：implications for cancer therapy development[J].J Cell Mol Med，2013，17（1）：12.

[6]張品南，馬紹英，楊海榮，等.西蘭花種子及其愈傷組織中蘿卜硫素含量比較[J].天然產物研究與開發，2013（25）：796.

[7]吳華彰，費鴻君，黃銀久，等.蘿卜硫素的體外抗氧化和抑菌活性[J].中國老年學雜志，2012，32（4）：70.

[8]Huang CS，Lin AH，Liu CT，et al.Isothiocyanates protect against oxidized LDL-induced endothelial dysfunction by upregulating Nrf2-dependent antioxidation and suppressing NFκB activation[J].Mol Nutr Food Res，2013，57（11）：1918.

[9]Shan Y，Zhao R，Geng W，et al.Protective effect of sulforaphane on human vascular endothelial cells against lipopolysaccharide-induced inflammatory damage[J].Cardiovasc Toxicol，2010，10（2）：139.

[10]Liu X，Zhao J，Xu J，et al.Protective effects of a benzoxazine derivative against oxidized LDL-induced apoptosis and the increases of integrin beta4，ROS，NF-kappaB and P53in human umbilical vein endothelial cells[J].Bioorg Med Chem Lett，2009，19（10）：2896.

[11]Ding XL，Zhang HY，Qi L，et al.Synthesis of novel pyrazole carboxamide derivatives and discovery of modulators for apoptosis or autophagy in A549lung cancer cells[J].Bioorg Med Chem Lett，2009，19（18）：5325.

[12]Sima AV，Stancu CS，Simionescu M.Vascular endothelium in atherosclerosis[J].Cell Tissue Res，2009，335（1）：191.

[13]Rajendran P，Rengarajan T，Thangavel J，et al.The vascular endothelium and human diseases[J].Int J Biol Sci，2013，9（10）：1057.