HPLC法同時(shí)測(cè)定鐵包金不同藥用部位中蘆丁和槲皮素的含量

王吉文，房志堅(jiān)，成金樂(lè)，嚴(yán)寒靜（.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州 50006；.中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東中山 58437）

鐵包金（Berchemia lineata）為鼠李科勾兒茶屬常用的一味民族藥，其主要來(lái)源包括細(xì)葉勾兒茶、光枝勾兒茶、多花勾兒茶、多葉勾兒茶的藤莖或根，具有消腫解毒、止血鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)除濕之功效，主治癰疽疔毒、咳嗽咯血、消化道出血、跌打損傷、燙傷、風(fēng)濕骨痛、風(fēng)火牙痛等癥[1-4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鐵包金中含有黃酮類、萜類、木脂素類等多種化學(xué)成分，其中黃酮類化合物蘆丁和槲皮素為其主要成分[5]，其對(duì)S180實(shí)體瘤有較好的抑制作用，且無(wú)順鉑的毒副作用[6-7]。為提高鐵包金的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)鐵包金根、莖、葉中的蘆丁和槲皮素的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料

1.1 儀器

600型HPLC儀，包括2487型紫外檢測(cè)器、Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；CP225D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ-500型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀有限公司）。

1.2 試劑

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200707）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-200907）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

1.3 藥材

鐵包金藥材經(jīng)廣東藥學(xué)院房志堅(jiān)副教授鑒定，分別為鼠李科勾兒茶屬植物細(xì)葉勾兒茶[Berchemia lineata（L.）DC.]、光枝勾兒茶（Berchemia polyphyllaWall）、多花勾兒茶[Berchemia floribunda（Wall.）Brongn.]，具體來(lái)源見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：迪馬ODS C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇（5 ∶1.5，V/V，A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，25%A；5～40 min，25%→60%A）；流速：0.9 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μl。在此色譜條件下，理論板數(shù)按槲皮素計(jì)不低于3 000；分離度均＞1.5。色譜見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取蘆丁和槲皮素對(duì)照品各3.76、4.62 mg，分別置10 ml量瓶中，加甲醇定容，即得蘆丁和槲皮素對(duì)照品貯備液。分別吸取上述對(duì)照品貯備液5.0、0.5 ml，置同一25 ml量瓶中，加甲醇定容，即得每1 ml含蘆丁75.20 μg、槲皮素9.24 μg的混合對(duì)照品溶液。另吸取上述蘆丁對(duì)照品貯備液0.4 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇定容，即得每1 ml含蘆丁6.02 μg的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取鐵包金根、藤莖、葉的干燥粉末（過(guò)2號(hào)篩）各2.0、1.0、0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入40、20、10 ml 80%乙醇，回流提取2 h，放冷，濾過(guò)，揮干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，將根、藤莖、葉提取物分別轉(zhuǎn)移至10、10、25 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25 μl，蘆丁對(duì)照品溶液2 μl，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得蘆丁和槲皮素的回歸方程分別為y＝1 063 575.51x+10 240.90（r＝0.999 8）、y＝3 012 505.50x－5 201.14（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，蘆丁和槲皮素的進(jìn)樣量分別在0.01～1.88、0.01～0.23 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取含蘆丁157.80 μg/ml、槲皮素11.30 μg/ml的混合對(duì)照品溶液10 μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)6次，記錄色譜圖。結(jié)果，蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.82%、1.63%（n＝6），表明所用儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取細(xì)葉勾兒茶（廣東中山）葉的干燥粉末（過(guò)2號(hào)篩）共6份，每份約0.1 g，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為1.79%、1.78%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取細(xì)葉勾兒茶（廣東中山）葉制成的供試品溶液10 μl，分別于0、2、4、6、8、12 h按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，蘆丁、槲皮素峰面積的RSD分別為0.34%、1.70%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的細(xì)葉勾兒茶（廣東中山）葉的干燥粉末（過(guò)2號(hào)篩）共6份，每份約50 mg，精密稱定，分別精密加入蘆丁、槲皮素對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.8 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地的鐵包金樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝2）

3 討論

3.1 提取方法的選擇

預(yù)試驗(yàn)中，筆者對(duì)比了不同提取溶劑（水、甲醇、乙醇）和提取方法（超聲、回流），結(jié)果提取效率為回流＞超聲，乙醇＞甲醇＞水；進(jìn)一步對(duì)乙醇的體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果采用80%乙醇回流提取2 h的提取效率最高。

3.2 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相考察了甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸、乙腈-甲醇-磷酸等溶液不同比例的等度與梯度洗脫。結(jié)果顯示，流動(dòng)相為乙腈-甲醇（5 ∶1.5，V/V，A）-0.2%磷酸（B）梯度洗脫時(shí)，色譜圖的基線平穩(wěn)，蘆丁、槲皮素峰形對(duì)稱，能與其他組分達(dá)到基線分離。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本研究對(duì)不同吸收波長(zhǎng)（250、260、285、360、370 nm）下的圖譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在360 nm波長(zhǎng)下，蘆丁、槲皮素與雜質(zhì)峰能較好分離，且吸光度較高。

3.4 蘆丁對(duì)照品溶液的制備

由于鐵包含不同部位樣品中蘆丁含量差距較大，為了保證所有樣品中蘆丁含量均在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，故本研究另制備另一低濃度的蘆丁單獨(dú)進(jìn)樣擴(kuò)大蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。

已有相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]對(duì)鐵包金中槲皮素的含量進(jìn)行了測(cè)定，但并未明確指出所用藥材各部位的含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鐵包金藥材中的蘆丁、槲皮素主要集中在葉和藤莖部位，根中的含量較低，其中多花勾兒茶根、藤莖部位不含蘆丁，可利用其特點(diǎn)與其他兩種植物區(qū)別開(kāi)來(lái)；葉的槲皮素含量高于藤莖，這與張榮祥等[9]的結(jié)論一致；6批不同產(chǎn)地的細(xì)葉勾兒茶樣品中，廣東廣州產(chǎn)的根、藤莖、葉中的蘆丁含量最高，廣東清遠(yuǎn)產(chǎn)的藤莖部位的槲皮素含量高于其他產(chǎn)地；不同品種葉的部位中，細(xì)葉勾兒茶蘆丁、槲皮素的含量最高，其次為光枝勾兒茶、多花勾兒茶。

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