正交試驗(yàn)優(yōu)選槐角中山奈酚的提取工藝

馬 敏，王 莉，李 芳，王衛(wèi)峰#（1.陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 71046；.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710065；.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 71000）

槐角為豆科植物槐Sophora japonicaL.的干燥成熟果實(shí)，性寒、味苦，歸肝、大腸經(jīng)，有清熱瀉火、涼血止血之功效[1]。槐角中含有多種以苷類(lèi)形式存在的黃酮類(lèi)化合物，其基本的苷元有4種，即槲皮素、染料木素、山奈酚和異鼠李素[2]，本研究將山奈酚含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。山奈酚又稱(chēng)山奈素、4′，5，7-三羥基黃酮醇等，主要是3位或3，7位成苷而在山奈、槐角、銀杏葉、金錢(qián)草中普遍存在的黃酮醇類(lèi)化合物，在槐角中含量最高，其藥理作用主要有抗氧化、抗炎、抗輻射和預(yù)防心血管疾病等藥理活性[3]。

筆者擬找到一條工藝合理、操作簡(jiǎn)單和成本低兼的水浸提法從槐角中將山奈酚提取出來(lái)，為工業(yè)化提取提供更多的選擇。本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)[4-8]，采取正交試驗(yàn)法，研究了各個(gè)影響因素，確定了槐角中山奈酚提取工藝的最佳條件。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC H-Class型超高效液相色譜儀，包括四元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、PDA檢測(cè)器、柱溫箱、EmpowerTM3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯天平有限公司）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；Synergy UV型超純水器（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥材

槐角購(gòu)于陜西省藥材公司，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院王衛(wèi)峰研究員鑒定為真品。

1.3 試劑

山奈酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110861-200304）；乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提取工藝

稱(chēng)取干燥槐角50 g，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，依次加熱回流水煎煮，濾過(guò)，合并濾液，加熱濃縮至200 ml，得提取液，貯藏，備用。

2.2 山奈酚含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液（23 ∶77，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.3 ml/min；進(jìn)樣量：1.0 μl。在此條件下山奈酚與其他組分可達(dá)到基線分離，理論板數(shù)按山奈酚計(jì)應(yīng)不低于4 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取山奈酚對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml含0.441 1 mg的對(duì)照品溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密移取“2.1”項(xiàng)下提取液10 ml，置于100 ml具塞錐形瓶中，加入10 ml甲醇和1 ml 25%鹽酸，于90 ℃水浴中受熱水解1 h，取出迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，用甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，濾液再用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝14 000 000x+6 012.2（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，山奈酚進(jìn)樣量在0.088 22～0.882 2 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3 單因素試驗(yàn)優(yōu)選鹽酸加入量

由于山奈酚主要與糖結(jié)合成苷而存在，所以需要用酸去水解而得到需要測(cè)定的山奈酚苷。筆者參考文獻(xiàn)[9-15]，在90 ℃下，分別加入0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 25%鹽酸，測(cè)定山奈酚含量，選擇最優(yōu)加入量。結(jié)果表明，加入1.0 ml 25%鹽酸水解后測(cè)定的山奈酚含量最高。25%鹽酸加入量對(duì)山奈酚含量的影響見(jiàn)表1。

表1 25%鹽酸加入量對(duì)山奈酚含量的影響Tab 1 Effect of adding amount of 25%hydrochloric acid on content of kaempferol

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選水提取工藝

以加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）為考察因素，每個(gè)因素各選3個(gè)水平，以山奈酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表2；正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3；方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of orthogonal test

由表3、表4可知，C因素即提取次數(shù)是主要影響因素，3個(gè)因素影響強(qiáng)弱順序?yàn)镃＞B＞A，即提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞加水量；優(yōu)選出的條件為A2B3C3，即12倍量水煎煮3次，每次2 h。

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of analysis of variance

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

稱(chēng)取槐角藥材150 g，共3份，按照最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定山奈酚含量。結(jié)果，每1 g槐角藥材中含山奈酚分別為19.07、19.16、18.99 mg，RSD＝0.45%。3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選出來(lái)的提取工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，能適合于大工業(yè)生產(chǎn)。

3 討論

槐角中山奈酚大多與糖結(jié)合成苷（如山奈酚-3-鼠李糖雙葡萄糖苷、山奈酚-3，7-雙葡萄糖苷）而存在，本試驗(yàn)采用酸水解后，測(cè)定指標(biāo)中的山奈酚含量為游離山奈酚及其苷水解后的山奈酚的總和。25%鹽酸加入量過(guò)多，也會(huì)對(duì)色譜柱有污染，因此應(yīng)先用單因素優(yōu)選出鹽酸用量。

由于山奈酚具有親脂性，易溶于熱乙醇、乙醚，微溶于水，在預(yù)試驗(yàn)中還考察了在相同條件下水提取、60%乙醇提取和95%乙醇提取的效果。結(jié)果表明，60%乙醇提取的山奈酚含量略高于水提取工藝，考慮到大生產(chǎn)的成本，選擇水提取更經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。

本試驗(yàn)用超高液相色譜儀測(cè)定山奈酚含量，分析時(shí)間短、重復(fù)性好、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便，可在幾分鐘內(nèi)完成分析，大大節(jié)約了分析時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。

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