正交試驗優選消疹止癢膠囊藥材的提取工藝

張 勇，紅 梅，錫林通嘎拉嘎，孟 竹，羅 璇（內蒙古自治區人民醫院藥學處，呼和浩特 010010）

消疹止癢膠囊是在我院名老中醫傳統方劑的基礎上研制而成的純中藥制劑，廣泛用于血虛風熱所致的各種皮膚疾病，尤其對于急、慢性蕁麻疹的療效較好[1-2]。該方由川芎、生地、桑白皮、地骨皮、白鮮皮、麻黃、蟬蛻、訶子等中藥組成，具有養血疏風、清熱止癢之功效，原以煎劑應用于臨床達40余年，療效甚佳，深受廣大患者認可。但是由于劑型的限制，使用上有諸多不便，故研制成膠囊。方中川芎有效成分阿魏酸微溶于水，可溶于熱水，水溶液中穩定性差，見光易分解，易溶于乙醇、甲醇、丙酮，難溶于苯、石油醚[3-4]；訶子中含有大量鞣質，其主要成分為訶子酸、沒食子酸等；沒食子酸易溶于水、乙醇等，幾乎不溶于苯、氯仿與石油醚[5]。為發揮其最大臨床療效，本研究根據藥物有效成分的性質和藥理作用，經過多次試驗和查閱有關文獻[6-10]，確定以阿魏酸、沒食子酸的含量為指標，采用正交試驗法對提取工藝進行系統考察，選出消疹止癢膠囊最優提取工藝。

1 材料

1.1 儀器

LC-10AT VP型高效液相色譜儀，包括LC-10ATvp泵、SCL-10Avp型控制器、SPA-10Avp型檢測器、CLASS-VP色譜工作站（日本島津公司）；J6MC型高速離心機（美國Beck-Man公司）。

1.2 藥材

川芎、生地、桑白皮、地骨皮、白鮮皮、麻黃、蟬蛻、訶子均購自內蒙古醫藥有限責任公司，經筆者鑒定為真品。

1.3 試劑

阿魏酸對照品（批號：0773-9910）、沒食子酸對照品（批號：0831-9501）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為高純水。

2 方法與結果

2.1 正交試驗優選消疹止癢膠囊藥材醇提工藝

2.1.1 提取工藝 精密稱取樣品9份，每份樣品按處方量分別精密稱取川芎、桑白皮、地骨皮、麻黃、白鮮皮按L9（34）正交試驗表進行乙醇提取，減壓回收乙醇至半稠膏，加入處方量一半的蟬蛻細粉，混勻，干燥，粉碎至粉末，備用。取本品0.5 g，研細，精密稱定，加20 ml 0.5%碳酸鈉溶液，超聲處理30 min，離心，取上清置分液漏斗中，藥渣用0.5%碳酸鈉溶液洗滌3次，每次10 ml，離心，取上清并入分液漏斗中，用HCl調pH至1～2，用25、25、20、20、20 ml乙醚萃取5次，乙醚液蒸干，用30%甲醇溶液微熱使溶解，定量轉移至10 ml棕色量瓶中，并用30%甲醇定容，離心，取上清，得消疹止癢膠囊醇溶藥材溶液。

2.1.2 含量測定（1）色譜條件。色譜柱：Phenomen kromasil C18（250 mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-1%冰醋酸（30 ∶70，V/V）；檢測波長：316 nm；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μl。理論板數按阿魏酸峰計不得低于3 000。（2）對照品溶液的制備。取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋制成每1 ml含10μg的阿魏酸對照品溶液，即得。（3）標準曲線的制備。精密稱取阿魏酸對照品2.5 mg，置50 ml棕色量瓶中，加甲醇定容，搖勻，精密吸取1、2、3、4、5、6 ml溶液，分別置10 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻。按“2.1.2（1）”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積積分值（y）為縱坐標，藥物質量濃度（x）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝7 515 745.48x－735.49（r＝0.999 9）。結果表明，阿魏酸質量濃度在0.053 8～0.322 8 μg/ml范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.1.3 正交試驗優選醇提工藝 根據文獻[11-12]及預試驗，以阿魏酸含量為評價指標，乙醇的體積分數（A）、乙醇的用量（B）、回流時間（C）、回流次數（D）為考察因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）正交表進行試驗。因素水平見表1；正交試驗結果見表2；方差分析結果見表3。

表1 因素與水平（n＝3）Tab 1 Factors and levels（n＝3）

表2 正交試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of orthogonal test（n＝9）

表3 方差分析結果Tab 3 Analysis of variance

由表2、表3中可知，各因素對試驗結果影響的大小順序為：C＞A＞D＞B；由方差分析結果可見，乙醇的體積分數（A）、乙醇的用量（B）、回流時間（C）、回流次數（D）對阿魏酸含量的影響均無統計學意義（P＞0.05）。根據試驗結果和實際生產情況，綜合各因素，選定最優提取工藝為A3B1C3D3，即8倍量90%的乙醇提取3次，每次1.5 h。

2.2 正交試驗優選消疹止癢膠囊藥材水提工藝

2.2.1 提取工藝 精密稱取樣品9份，每份樣品按處方量分別精密稱取生地、訶子按L9（34）正交試驗表進行水提取，減壓濃縮至半稠膏，加入處方量一半的蟬蛻細粉，混勻，干燥，粉碎至粉末，備用。取本品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，搖勻，稱定質量，放置過夜，超聲處理30 min，放冷，稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 ml，水浴蒸干，殘渣用流動相溶解，轉移至25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，得消疹止癢膠囊水溶藥材溶液。

2.2.2 含量測定（1）色譜條件。色譜柱：Phenomen kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：2%甲醇的乙腈溶液-0.1%三乙胺、0.1%磷酸等比混合溶液（3 ∶97，V/V）；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μl。理論板數按沒食子酸峰計算應不低于5 000。（2）對照品溶液的制備。取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1 ml含15μg的沒食子酸對照品溶液。（3）標準曲線的制備。精密稱取沒食子酸對照品0.374 mg，置25 ml棕色量瓶中，加流動相定容，搖勻，精密吸取1、2、4、6、8、10 ml溶液，按“2.2.2（1）”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積積分值（y）為縱坐標，藥物質量濃度（x）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝21 406.2x－120 506.5（r＝0.999 5）。結果表明，沒食子酸質量濃度在0.014 96～0.149 6 μg/ml范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.2.3 正交試驗優選水提工藝 根據預試驗[11-12]，以沒食子酸含量為評價指標，加水量（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數（C）、浸泡時間（D）為考察因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）正交表進行試驗。因素水平見表4；正交試驗結果見表5；方差分析結果見表6。

表4 因素與水平（n＝3）Tab 4 Factors and levels（n＝3）

表5 正交試驗結果（n＝9）Tab 5 Results of orthogonal test（n＝9）

表6 方差分析結果Tab 6 Analysis of variance

從表5、表6中可以看出，各因素對試驗結果影響的大小順序為：A＞C＞D＞B：由方差分析結果可見，加水量（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數（C）、浸泡時間（D）對沒食子酸含量的影響均無統計學意義（P＞0.05）。根據試驗結果和實際生產情況，綜合各因素，選定最優提取工藝為A1B1C3D3，即8倍量水浸泡2 h后煎煮3次，每次1 h。

2.3 驗證試驗

按上述優選的最優工藝，制備3批消疹止癢膠囊（批號：20100916、20100917、20100918）樣品，對工藝進行驗證。依照該制劑質量標準方法進行含量測定[13]，測得阿魏酸的含量分別為0.082 0、0.082 2、0.078 3 mg/g，RSD＝2.72%；沒食子酸的含量分別為2.814 0、2.796 0、2.809 0 mg/g，RSD＝0.93%。驗證結果表明，優選出的工藝穩定可行。

3 討論

本試驗是綜合處方中藥物有效成分的理化性質和藥理作用及生產實踐等多方面的因素，經多次試驗研究、分析比較而確定分別采用醇提和水提法[14]。川芎中主要含有揮發油、川芎嗪、阿魏酸、多糖等，桑白皮主要含有黃酮類衍生物、香豆類衍生物和三萜類化合物；地骨皮含有甜菜堿、β-谷甾醇、亞油酸、桂皮酸及多種酚性物質等；白蘚皮、麻黃主要成分均為生物堿類，這些成分在醇中均有一定的溶解性，故采用醇提的方法提取。方中君藥川芎因其有效成分川芎嗪易升華，在工藝制備過程中損失較大，成品中轉移率較低，測定其含量無實際意義，故選擇阿魏酸為指標性成分，運用高效液相色譜法對制劑中川芎的阿魏酸進行含量測定，通過L9（34）正交試驗設計對工藝條件進行優選。

地黃為方中臣藥，主要含梓醇等環烯醚萜苷類化合物和多糖，具有清熱涼血、滋陰、提高人體免疫力等功效。地黃與訶子中的成分在水中具有一定溶解性，故采用水提法。但是，梓醇化學性質不穩定，易被氧化分解，所以選擇以沒食子酸（訶子）的含量為評價指標，對水提取工藝條件進行優選。

根據試驗結果及生產實際情況，乙醇提取物中以阿魏酸的含量為評價指標，全面考察了影響乙醇提取效率的因素；以沒食子酸含量為評價指標，考察了影響水提工藝主要因素。結果表明，優選出的最佳工藝操作簡便、穩定可行，有效成分得到很好的保留。

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