正交試驗優選暑熱寧口服液揮發性活性物質的提取工藝Δ

李鳳麗，李 進，高文遠，陳 濤#，王進博（.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 009；2.天津中醫藥大學研究生部，天津 009；.天津大學生命科學院，天津 009）

暑熱寧口服液為天津中醫藥大學第一附屬醫院臨床使用多年的醫院制劑，多用于治療兒童急性上呼吸道感染暑濕兼寒證，該方以葛根芩連湯、藿連湯與香薷飲三方化裁，由廣藿香、香薷、厚樸等13味中藥材提取制備而成。

研究資料表明，方中香薷、廣藿香、厚樸均含有揮發性活性物質[1-4]，為保證復方藥效，擬將此類成分單獨提取處理后入藥。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取香薷、廣藿香、厚樸混合蒸餾液[5-6]，并以香薷活性成分麝香草酚和香荊芥酚含量為考察指標，以L9（34）正交設計優選最佳提取工藝，最大程度提取暑熱寧口服液中的揮發性成分，為其作為新藥研究提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

7980A（FID）型氣相色譜儀（美國Agilent公司）；TCQ250型超聲波清洗器（北京醫療設備二廠）；JA2003型電子分析天平（上海精科天平廠）。

1.2 飲片

香薷（批號：C12080101）、厚樸（批號：E12080101）由河北康派中藥材有限公司提供；廣藿香（北京盛世龍藥業有限公司，批號：1111124）。以上藥材均經天津中醫藥大學第一附屬醫院陳濤教授鑒定為真品。

1.3 試劑

麝香草酚對照品（批號：100508-200902）、香荊芥酚對照品（批號：111691-200501）由中國食品藥品檢定研究院提供；正己烷為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：HP-5彈性石英毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；柱升溫程序：起始溫度110 ℃，保持10 min，25 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持9.2 min；進樣口溫度：220℃；FID檢測器溫度220 ℃；載氣：高純N2（＞99.99%）；柱流量1.0 ml/min；分流比：10∶1（V/V）；分流進樣量：1μl。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取麝香草酚和香荊芥酚對照品適量，用正己烷制備成麝香草酚質量濃度為0.52 mg/ml和香荊芥酚質量濃度為0.29 mg/ml的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取正交試驗優選工藝下制備的蒸餾液10 ml，加入環己烷等體積萃取，萃取3次，每次30min，合并萃取液，自然揮干，正己烷溶解并定容于2 ml量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性溶液的制備 根據處方精密稱取厚樸、廣藿香藥材適量，按“2.1.3”項下方法制備陰性對照溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。色譜見圖1。

圖1 氣相色譜圖A.混合對照品；B.供試液；C.陰性對照；D.空白對照Fig 1 GC chromatogramsA.mixed control；B.test solution；C.negative control；D.blank control

2.1.5 標準曲線的制備 以正己烷為溶劑制成一系列不同質量濃度的混合標準溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以質量濃度（x，ng/μl）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得麝香草酚和香荊芥酚回歸方程分別為y＝1748.1x+31.5（r＝0.999 92）、y＝1629.4x+16.5（r＝0.999 86）。結果表明，麝香草酚和香荊芥酚質量濃度分別在0.080～2.603 mg/ml、0.045～1.455 mg/ml范圍內與其峰面積積分值呈良好線性關系。

2.1.6 精密度試驗 取混合對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，連續6次。結果，麝香草酚和香荊芥酚的RSD分別為0.9%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重現性試驗 取同一批樣品適量，共6份，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，麝香草酚和香荊芥酚的RSD分別為1.2%、1.0%，表明方法重現性好。

2.1.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液適量，室溫放置，分別于0、2、4、6、12、24、48 h按“2.1.1”項下色譜添加進樣測定，記錄色譜圖。結果，麝香草酚和香荊芥酚的RSD分別為0.3%、0.3%，表明溶液在48 h內基本穩定。

2.1.9 加樣回收率試驗 稱取同一樣品9份，每份5 ml，每3份為一組。每組3份樣品分別精密加入含麝香草酚1.526 8 mg/ml、香荊芥酚0.494 7mg/ml的對照品溶液0.5、1.0、1.5 ml。按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，根據加入量計算回收率。結果，麝香草酚和香荊芥酚的加樣回收率分別為97.9%～101.5%、98.2%～102.4%，RSD分別為1.8%、2.1%。

2.2 單因素試驗[7]

2.2.1 提取蒸餾液體積考察 按處方量取香薷、厚樸、廣藿香3味藥材加10倍量水，分別提取生藥量的0.5、1.0、1.5、2.0、2.5倍蒸餾液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并按外標法計算樣品中麝香草酚和香荊芥酚含量。提取蒸餾液體積倍數對麝香草酚和香荊芥酚含量的影響見圖2。

圖2 提取蒸餾液體積倍數對麝香草酚和香荊芥酚含量的影響A.麝香草酚；B.香荊芥酚Fig 2 Effect of extraction distillation and liquid volume of thymol and cavacrol grass phenol contentA.thymol；B.carvacrol

2.2.2 浸泡時間考察 按處方量取香薷、厚樸、廣藿香3味藥材加10倍量水，分別提取生藥浸泡時間為0、3、6、12、24 h的蒸餾液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并按外標法計算樣品中麝香草酚和香荊芥酚含量。浸泡時間對麝香草酚和香荊芥酚含量的影響見圖3。

圖3 浸泡時間對麝香草酚和香荊芥酚含量的影響A.麝香草酚；B.香荊芥酚Fig 3 Effect of time of thymol and cavacrol grass phenol contentA.thymol；B.carvacrol

2.2.3 蒸流速度考察 按處方量取香薷、厚樸、廣藿香3味藥材加10倍量水，提取蒸餾液速度為30～40、50～60、70～80、90～100、110～120滴/min。按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并按外標法計算樣品中麝香草酚和香荊芥酚含量。蒸流速度對麝香草酚和香荊芥酚含量的影響見圖4。

圖4 蒸餾速度對麝香草酚和香荊芥酚含量的影響A.麝香草酚；B.香荊芥酚Fig 4 Effect of distillation rate of thymol and cavacrol grass phenol contentA.thymol；B.carvacrol

2.3 正交試驗[8-10]

根據單因素考察結果，以提取蒸餾液倍數（A）、浸泡時間（B）、蒸餾速度（C）為考察因素，分別以麝香草酚和香荊芥酚含量為考察指標，采用L9（34）正交表進行試驗。因素水平見表1；正交試驗、方差分析結果見表2～表5。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結果（以麝香草酚為考察指標）Tab 2 Results of orthogonal experiment（using thymol as index）

表3 方差分析結果（以麝香草酚為考察指標）Tab 3 Analysis of variance（using thymol as index）

由表1～表5可知，對麝香草酚和香荊芥酚含量影響由強到弱順序均為A＞C＞B，即提取蒸餾液倍數影響最大。由于麝香草酚含量遠高于香荊芥酚含量且相關資料表明麝香草酚藥效活性較明顯，因此首先考慮麝香草酚提取影響的因素，其次要考慮香荊芥酚提取的影響因素。綜合分析，最優提取工藝為A2B2C1，即提取蒸餾液倍數為1.5倍，浸泡12 h，蒸餾速度30～40滴/min。為驗證提取1.5倍蒸餾液后是否將有效活性物質提取充分，筆者進行了其與提取2倍量倍蒸餾液和3倍量倍蒸餾液有效活性物質含量比較，發現三者所含有效活性物質總量較接近。

表4 正交試驗結果（以香荊芥酚為考察指標）Tab 4 Results of orthogonal experiment（using carvacrol as index）

表5 方差分析結果（以香荊芥酚為考察指標）Tab 5 Analysis of variance（using carvacrol as index）

2.4 工藝驗證試驗

按處方量取香薷、厚樸、廣藿香3味藥材，在正交試驗設計所優選的工藝條件下進行驗證試驗，測定最佳工藝條件下的麝香草酚和香荊芥酚含量，可見該工藝穩定可行。驗證試驗結果見表6。

表6 驗證試驗結果Tab 6 Results of verification test

3 討論

本試驗根據預試驗與資料查詢直接采用生藥量10倍量水提取蒸餾液，加水量過少對藥材浸透效果差，不易于有效物質提取；加水量過多，耗費能源，增加成本。同時，由于影響該試驗主要因素較多，所以不將加水量定為考察因素，而將提取蒸餾液倍數、浸泡時間、蒸餾速度作為主要考察對象進行研究。

香薷、厚樸、廣藿香3味藥材均含有揮發性活性物質，根據預試驗發現其他藥材有效物質含量及穩定性均較低于香薷中麝香草酚和香荊芥酚，為保證該工藝的合理性，本試驗以麝香草酚和香荊芥酚兩個指標綜合評價最佳工藝，結果穩定可行。

預試驗進行了香薷、厚樸、廣藿香3味中藥材提取揮發油和提取蒸餾液比較。二者有效物質含量基本相近，由于提取物要溶于水溶液，而暑熱寧口服液又為兒童用藥，不允許添加乙醇等潛溶劑，所以選擇提取蒸餾液較為合理。

在供試品溶液的制備上，采用了環丙烷、三氯甲烷、乙醚、正己烷、石油醚（30～60 ℃）、石油醚（60～90 ℃）、甲苯、乙酸乙酯萃取[11-12]，同時對萃取時間和萃取溶劑體積進行了考察，結果發現以環丙烷等體積萃取3次，每次30 min，萃取效果最佳。

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