微生物對茶葉中嘌呤生物堿代謝的研究進(jìn)展

馬存強(qiáng)，楊 超，周斌星,2,*，任小盈，李 靜，李發(fā)志

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；3.云南省保山市隆陽區(qū)茶葉技術(shù)推廣站，云南 保山 678000）

微生物對茶葉中嘌呤生物堿代謝的研究進(jìn)展

馬存強(qiáng)1，楊 超1，周斌星1,2,*，任小盈1，李 靜1，李發(fā)志3

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；3.云南省保山市隆陽區(qū)茶葉技術(shù)推廣站，云南 保山 678000）

嘌呤堿是茶葉中重要的內(nèi)含物質(zhì)，常應(yīng)用于醫(yī)療保健和食品飲料等行業(yè)。在黑茶渥堆和茶葉微生物發(fā)酵期間嘌呤堿出現(xiàn)種類和含量的變化。為探究微生物與嘌呤堿代謝的關(guān)系，本文對近年國內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)不同微生物單菌種發(fā)酵對嘌呤堿含量和種類影響不一，頂頭孢霉（Cephalosporium acremonium）能顯著提高茶葉中咖啡堿含量；煙曲霉（Aspergillus fumigatu）、乳酸菌（Lactobacillus）、醋酸型乳酸菌（acetic acid Lactobacillus）等對嘌呤堿含量影響不大；酵母菌（yeast）、聚多曲霉（Aspergillus sydowii）對咖啡堿有降低作用；黑曲霉（Aspergillus niger）對嘌呤堿代謝影響存在爭議；咖啡堿與茶葉堿存在消長關(guān)系。

茶葉；微生物；嘌呤堿；咖啡堿；代謝

茶葉年人均消費(fèi)量已達(dá)0.5 kg，已經(jīng)超過咖 啡、啤酒、葡萄酒和碳酸飲料，成為第一大飲料[1]。這得益于人們對茶葉保健功效的認(rèn)識和認(rèn)可。大量在人體、動物和實(shí)驗(yàn)室狀態(tài)下的研究表明，茶葉具有減少腰部脂肪堆積[2]、抗炎殺菌[2-3]、抗氧化[4]、減少動脈粥樣硬化機(jī)率[5]和一定的防癌抗癌[6-8]等功效作用。這得益于茶葉中的功能成分，如茶多酚、茶色素、茶多糖、氨基酸等。嘌呤類生物堿亦是茶葉中重要的呈味物質(zhì)和功能成分。

1 茶葉中嘌呤生物堿的種類和功效

茶葉生物堿主要為嘌呤類生物堿以及少量的嘧啶類生物堿。嘌呤類生物堿有咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤，caffeine）、茶堿（1,3-二甲基黃嘌呤，theophylline）、可可堿（3,7-二甲基黃嘌呤，theobromine）、黃嘌呤（xanthine）、次黃嘌呤（hypoxanthine）、擬黃嘌呤（1,7-二甲基黃嘌呤，paraxanthine），以及在云南省苦茶中首次分離出的苦茶堿（1,3,7,9-四甲基尿酸，theacrine）[9]和云南普洱熟茶中分離鑒定出的8-氧化咖啡因（8-oxocaffeine）[10]。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是以嘌呤環(huán)為基本骨架，嘌呤堿的種類取決于嘌呤環(huán)上甲基的位置和個數(shù)。嘧啶類生物堿有胸腺嘧啶脫氧核苷（deoxythymidine）、胸腺嘧啶（hymine）、尿嘧啶（uraci）。在普通品種中，咖啡堿占干質(zhì)量的2%～4%，可可堿約占0.05%，茶堿約占0.002%。

生物堿的種類和含量受到茶樹生長的季節(jié)、品種以及茶葉加工工藝不同的影響。Wang等[11]對2009年4—9月生長的茶鮮葉研究表明嘌呤類生物堿的含量隨季節(jié)起伏較大，并在8月份含量達(dá)到頂峰，咖啡堿含量相對穩(wěn)定，只有波浪狀起伏。在不同品種生物堿含量研究中，較具有代表性的為可可茶無性系品種[12]，其鮮葉不含咖啡堿和茶堿，而是以可可堿為主；苦茶樹（Camellia assamica var. kucha）[13]的鮮葉中含有苦茶堿（1,3,7,9-四甲基尿酸），對咖啡堿引起的神經(jīng)系統(tǒng)興奮有抑制作用[9]。在對同為綠茶品種的龍井43號和安吉白茶的生物堿差異化研究中發(fā)現(xiàn)，可可堿含量有顯著差異，咖啡堿差異明顯[14]。加工工藝的不同也造成了茶葉中生物堿含量的變化，一般咖啡堿含量高低的次序?yàn)椋杭t茶（完全發(fā)酵茶）＞烏龍茶（半發(fā)酵茶）＞綠茶（不發(fā)酵茶）[15]。同時也有研究表明隨著發(fā)酵程度的加深，咖啡堿和可可堿含量降低[16]。這或許與咖啡堿的存在形式、測定方法以及茶樹生長地理環(huán)境、鮮葉的年齡和質(zhì)量有關(guān)（表1）。

表1 茶葉中主要嘌呤堿的功效與潛在危險Table1 Efficacy and potential risks of principal purine alkaloids in tea

2 茶葉加工中的微生物

在普洱生茶、普洱熟茶、茯磚茶、康磚茶的加工與貯藏過程中，微生物大量參與并對茶葉的化學(xué)成分和品質(zhì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響（表2）。早期普洱茶（普洱生茶）自然存放，通過自然環(huán)境中微生物類群作用以達(dá)到自然陳化[27]。對陳放15、25 年普洱生茶作微生物分離鑒定得到橙黃色游動放線菌（Actinoplanes aurantiacus）、淡橘橙游動放線菌（Actinoplanes pallidoaurantiacus）、絳紅褐游動放線菌（Actinoplanes purpeobrunneus）、鏈霉屬桿菌（Streptomyces bacillaris）、卡伍爾鏈霉菌卡伍爾亞種（Streptomyces cavourensis subsp. cavourensis）、灰黑色鏈霉菌（Streptomyces cinereus）[28-29]。Zhao等[30]在2010年從60 個不同茶樣中分離出71 種真菌，鑒定出其中的63 種，分屬于19 個不同的屬，分別為曲霉屬（Aspergillus sp.）、青霉屬（Penicillium sp.）、酵母菌屬（yeast）、木霉屬（Trichoderma sp.）、芽枝霉菌屬（Cladosporium sp.）、子囊菌屬（Ascomycete sp.）和黏隔孢屬（Septogloeum sp.）、小球腔菌屬（Leptosphaeria sp.）、脈孢菌屬（Neurospora sp.)、踝節(jié)菌屬（Talaromyces sp.）、根毛菌屬（Rhizomucor sp.）、Pezia sp.、彎孢聚殼屬（Eutypella sp.）、肉座菌屬（Hypocrea sp.）、鐮刀霉菌（Fusarium sp.）、白腐菌屬（Phanerochaete sp.）、松慶病菌屬（Trametes sp.）、柯楠屬（Corynascus sp.）、犁頭霉菌屬（Absidia sp.）。普洱熟茶以云南曬青毛茶為原料，經(jīng)潮水渥堆加工而成。在普洱茶渥堆過程中分離出40余種真菌，分屬于19 個不同的屬，其中曲霉屬、青霉屬、酵母菌屬占普洱茶菌落的80%左右[31]。隨著溫度的升高，嗜熱菌在渥堆中后期大量出現(xiàn)[32]，并鑒定為微小根毛霉（Rhizomucor pusilus）、牛根毛霉（Rhizomucor t a u r i c u s）、疏棉嗜熱絲孢菌（T h e r m o m y c e s lanuginosus）、埃莫森籃狀菌（Talaromyces emersonii）等嗜熱菌。黑曲霉[33]和酵母菌[34]被認(rèn)為是普洱茶的優(yōu)勢菌，并在普洱茶加工中得以應(yīng)用。茯磚茶與普洱茶同屬于黑茶范疇，以獨(dú)特的發(fā)花工序而著稱。茯磚茶中鑒定出的微生物有冠突散囊菌、間型散囊菌、匍匐散囊菌、謝瓦散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌、赤散囊菌、散囊菌、黑曲霉、毛霉、擬青霉、草酸青霉、短密青霉、謝瓦氏曲霉、冠突曲霉等。優(yōu)勢菌群為冠突散囊菌（Eurotium cristatum（Raper & Fennell） Malloch & Cain）。冠突散囊菌在四川康磚茶中亦有檢出，對康磚茶品質(zhì)產(chǎn)生影響的微生物同時還有放線菌屬、毛霉屬和耐熱葡萄球菌等。以嶺頭單叢曬青毛茶為原料后發(fā)酵而成廣東陳香茶中的優(yōu)勢菌群分別為黑曲霉、產(chǎn)黃青霉和灰綠霉[35]。

綠茶、黃茶和白茶為不發(fā)酵或微發(fā)酵茶，加工過程應(yīng)杜絕微生物的參與，以避免污染。然而，微生物在茶的再加工與深加工有巨大應(yīng)用前景。酵母菌、真菌、細(xì)菌等三大微生物是影響紅茶品質(zhì)的最主要微生物，研究表明紅茶、烏龍茶中有益微生物的適度添加可顯著提高茶葉品質(zhì)[36]。

表2 茶葉加工中的微生物種類Table2 Major microorganism species during tea processing

3 微生物對茶葉中嘌呤堿含量的影響

3.1 自然渥堆發(fā)酵過程中嘌呤堿含量的變化

黑茶渥堆是以茶葉為基質(zhì)，眾多微生物參與的固態(tài)發(fā)酵過程。在普洱茶渥堆期間，水浸出物略微下降、茶多酚含量大幅度下降、茶褐素急劇上升[37-38]。不同產(chǎn)地的普洱茶咖啡堿含量無顯著性差異。在普洱茶自然渥堆過程中，咖啡堿略有上升[39]。Wang Di等[40]研究與之相反，渥堆末期咖啡堿含量較原料有所降低。這或許與渥堆過程中優(yōu)勢菌種的差異相關(guān)。在普洱茶渥堆期間添加發(fā)酵劑可加快咖啡堿的變化，降低熟茶的生產(chǎn)周期。在利用添加鮮葉浸提物的微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中[41]，浸提物的添加可降低咖啡堿的含量，而菌種不同會對咖啡堿產(chǎn)生不同的結(jié)果。

3.2 可降解咖啡堿菌株的篩選

為了生產(chǎn)低咖啡堿茶葉（咖啡堿含量小于1%），國內(nèi)外科技工作者采取熱水浸提、超臨界CO2提取、有機(jī)物萃取等物理化學(xué)方法脫去茶葉中多余的咖啡堿，或通過雜交育種選育低咖啡堿的茶樹新品種。通過茶、咖啡園土壤篩選可降解咖啡堿的菌株同樣取得可喜成果。利用咖啡堿作為唯一碳源和氮源，Gokulakrishnan等[42]從土壤中篩選出Pseudomonas sp. GSC1182菌株，該菌株在48 h內(nèi)能降解掉培養(yǎng)基中80%的咖啡堿。Brand等[43]研究發(fā)現(xiàn)微生物的咖啡堿降解效率與溫度有關(guān)，曲霉菌和青霉菌等真菌在25 ℃條件下的降解率為100%，在30 ℃條件下時僅為80%。國內(nèi)同樣有相關(guān)研究[44-45]，栗娜等[44]在杭州茶園篩選出對咖啡堿降解效率達(dá)100%的菌株，經(jīng)分子學(xué)鑒定為假單胞菌屬的Pseudomonas lutea。柴潔[45]以普洱茶渥堆茶樣為實(shí)驗(yàn)材料，篩選出可降解咖啡堿菌株，經(jīng)18S rDNA測序鑒定為聚多曲霉（Aspergillus sydowii NRRL250），并進(jìn)行單菌落茶葉發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，咖啡堿含量大幅度下降，至末期含量甚微；茶葉堿含量大幅度上升，末期時茶葉堿含量達(dá)2.814%。咖啡堿與茶葉堿存在消長關(guān)系。在微生物發(fā)酵過程中，咖啡堿存在著與植物中咖啡堿相似的降解途徑。

3.3 單菌株茶葉發(fā)酵嘌呤堿含量變化

對不同微生物單菌株發(fā)酵的研究證實(shí)不同微生物對嘌呤堿含量和種類影響不一（表3）。利用頂頭孢霉的單菌落發(fā)酵普洱茶過程中咖啡堿含量大幅度上升[46]。在Qin Jinhua等[47]研究中證實(shí)煙曲霉（Aspergillus fumigatu）對咖啡堿和可可堿的含量影響不大，黑曲霉（Aspergillus niger）可顯著降低咖啡堿的含量。Wang Xiaogang等[48]對不同微生物對茶葉發(fā)酵過程中咖啡堿及生物堿含量的研究發(fā)現(xiàn)，Tieghem ACCC30005、R. arrhizus Fisher3.2893和M. circinelloides van. Tieghem AS3.2484，能夠提高發(fā)酵過程中咖啡堿的含量而酵母菌、C. albicans（Robin）Berkhout ACCC2100和C. famata（Saito）Lodder ACCC2052能夠降低發(fā)酵過程中咖啡堿的含量。這與Pasha等[49]研究酵母菌能降低紅茶發(fā)酵咖啡堿含量的結(jié)論相符。在黑曲霉發(fā)酵普洱茶過程中咖啡堿含量略有上升，與Wang Xiaogang等[48]結(jié)果不一致。Nishino等[50]通過乳酸菌和醋酸型乳酸菌對濕潤的綠茶廢料發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)咖啡堿含量沒有明顯變化。研究冠突散囊菌[51]對綠茶液發(fā)酵過程中的影響，在0～8 d的發(fā)酵液中咖啡堿含量保持穩(wěn)定，隨著菌絲體的產(chǎn)生，咖啡堿下降到11.97 mg/mL。

表3 不同微生物對嘌呤類生物堿的影響Table3 Effects of different microorganisms on purine alkaloids

4 結(jié) 語

目前，在普洱茶以及黑茶渥堆發(fā)酵與陳化過程中分離鑒定出超過71 株真菌，6 株放線菌和7類細(xì)菌。另外有5 類微生物被證實(shí)對咖啡堿有顯著降解作用。這為研究微生物與咖啡堿等嘌呤堿的關(guān)系以及低咖啡堿茶葉的生產(chǎn)提供了豐富的菌種來源。在以曬青毛茶、綠茶、紅茶等不同茶葉為基質(zhì)的微生物發(fā)酵中，黑曲霉、酵母菌、頂頭孢霉、聚多曲霉等真菌對茶葉中咖啡堿含量有顯著影響。煙曲霉、乳酸菌、醋酸型乳酸菌、冠突散囊菌等微生物對咖啡堿、可可堿等嘌呤堿含量產(chǎn)生或多或少的影響。而茶葉微生物發(fā)酵過程中，咖啡堿、可可堿、茶葉堿等嘌呤堿的代謝途徑尚不清晰；不同嘌呤堿之間的消長關(guān)系和內(nèi)在聯(lián)系值得進(jìn)一步研究。

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Recent Progress in Microbial Metabolism of Purine Alkaloids in Fermented Tea

MA Cun-qiang1, YANG Chao1, ZHOU Bin-xing1,2,*, REN Xiao-ying1, LI Jing1, LI Fa-zhi3
(1. LongRun Pu-erh Tea College, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. College of Tea and Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 3. Yunnan Province Baoshan City Longyang Tea Technical Extension Station, Baoshan 678000, China)

As important substances present in tea, purine alkaloids are often employed in medicine and health care as well as drinks. The kinds and contents of purine alkaloids are potentially changed during microbial fermentation of tea. After reviewing recent literature regarding the association of microorganisms with the metabolism of purine alkaloids in fermented tea, this article fi nds that different strains, when used individually to ferment tea, have different effects on the kinds and contents of purine alkaloids. C ephalosporium acremonium can substantially enhance caffeine c ontents in tea, Aspergillus fumigatu, Lactobacillus, and acetic acid Lactobacillus have little impact on the contents purine alkaloids, and yeast and Aspergillus sydowii NRRL 250 can reduce caffeine contents. However, the effect of Aspergillus niger on purine alkaloid metabolism remains controver sial. In addition, a trade-off relationship between caffeine and theophyllin e exists during tea fer mentation.

tea; microorganism; purine alkaloids; caffeine; metabolism

S571.1

A

1002-6630（2014）21-0292-05

10.7506/spkx1002-6630-201421057

2013-12-27

“十一五”國家科技支撐計劃項(xiàng)目（2007BAD58B03）；保山市科技項(xiàng)目-保山市特種茶葉開發(fā)與研究項(xiàng)目

馬存強(qiáng)（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)椴枞~加工與綜合利用。E-mail：macunqiang1208@aliyun.com

*通信作者：周斌星（1963—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)椴枞~加工。E-mail：bxzhou01@126.com