富硒綠茶對大鼠非酒精性脂肪肝Ca2+-ATPase活性和表達的影響

王鳳杰，陳顯兵,*，張書毓，譚志鑫，向國敏，劉錦紅

（1.湖北民族學院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院科技學院，湖北 恩施 445000）

富硒綠茶對大鼠非酒精性脂肪肝Ca2+-ATPase活性和表達的影響

王鳳杰1,2，陳顯兵1,2,*，張書毓2，譚志鑫2，向國敏2，劉錦紅2

（1.湖北民族學院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院科技學院，湖北 恩施 445000）

目的：研究恩施富硒綠茶對大鼠非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）中肝臟肌漿網/內質網Ca2+-ATPase（sarco（endo）plasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）活性及其表達的影響，探討富硒綠茶防治NAFLD的可能作用機制。方法：將32 只Wistar大鼠分成4 組，分別飼喂標準飼料+常規飲水（NC組）、高脂飼料+常規飲水（HC組）、高脂飼料+普通綠茶（TC組）、高脂飼料+富硒綠茶（SeC組）。9 周后處死，觀察大鼠一般情況，測定肝細胞內Ca2+含量、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平、肝臟組織ATPase活性；采用免疫組化染色和Western blotting檢測肝臟內總SERCA蛋白表達，觀察各指標變化情況。結果：HC組大鼠肝細胞內Ca2+含量明顯增高，Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性降低，SERCA蛋白表達降低；富硒綠茶干預后Ca2+含量降低，酶活性升高，表達增加，較普通綠茶效果明顯。結論：富硒綠茶對高脂飲食誘導的大鼠非酒精性脂肪肝病具有干預作用，可能是通過降低肝細胞內Ca2+和TNF-α含量而改善肝臟能量代謝障礙，同時提高了SERCA活性，增強其蛋白表達而實現的。

富硒綠茶；非酒精性脂肪肝病；肌漿網/內質網Ca2+-ATPase

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已愈來愈成為全球關注的健康問題，由內質網結構和功能異常導致的內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）和脂質代謝障礙是研究熱點之一。Ca2+廣泛分布于細胞質、細胞核、內質網、高爾基體等部位，在細胞分化、凋亡、免疫等多方面發揮重要作用[1]，肌漿網/內質網Ca2+-ATPase（sarco（endo）plasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）是ATP依賴性的Ca2+轉運酶，主要分布在內質網和肌漿網膜上。細胞內氧化應激可以破壞內質網穩態，啟動Ca從內質網Ca池的釋放，增加活性氧的產生，進而放大氧化應激及Ca負載，引起惡性循環。前期研究已證實NAFLD大鼠肝臟內抗氧化酶活性降低，脂質過氧化反應增強，提示氧化應激和脂質過氧化反應可能參與了NAFLD的發生[2]，而且富硒綠茶具有降低脂肪肝形成、清除自由基、提高抗氧化酶活性、抑制脂質過氧化反應等功效[2-3]。那么富硒綠茶在預防和治療NAFLD的發生發展過程中的機制是怎樣的呢？本實驗通過高脂飲食誘導NAFLD大鼠模型，觀察富硒綠茶干預后脂肪肝的氧化性損傷及SERCA活性及表達情況，探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

Wistar大鼠32 只，由湖北省實驗動物研究中心提供（生產許可證號：SCXK（鄂）2008-0005；使用許可證號：SYXK（鄂）2008-0014），雌雄各半，體質量180～200 g。

富硒綠茶為恩施富硒區宣恩伍家臺貢茶，采用示波極譜法檢測出富硒綠茶的硒含量為3.235 8 μg/g，武漢某普通綠茶硒含量為0.428 57 μg/g。飼料由湖北省實驗動物研究中心提供，高脂飼料配方如下（以下均為質量分數）：標準飼料80%，豬油10%，蛋黃粉10%[4]。

膽固醇 武漢化學試劑公司；ATPase測定試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫試劑盒 南京建成生物工程研究所；SERCA抗體 美國Santa Cruz公司；內參β-actin（1∶2 000）美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

5418型離心機 德國Eppendorf公司；UV-5300紫外-可見分光光度計 西安德派生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及模型建立

Wistar大鼠32 只，常規喂養1 周后分為4 組，每組8 只。正常對照組（NC組）、高脂模型組（HC組）、普通綠茶組（TC組）及富硒綠茶組（SeC組）；NC組喂標準飼料，HC、TC及SeC組喂高脂飼料，均自由飲水，在此基礎上，NC和HC 2 組均用蒸餾水（3 mL/d）灌胃作為對照；2 種綠茶分別加沸蒸餾水配成質量分數10%茶溶液，TC組用普通綠茶溶液灌胃（1.5 g/（kg·d）），SeC組灌胃富硒綠茶溶液（1.5 g/（kg·d））。按上述要求持續喂養9 周后處死，進行各項指標檢測。

1.3.2 觀察指標及測定分析方法

1.3.2.1 肝臟組織病理學檢測

取肝臟組織用質量分數10%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肝臟脂肪變性、炎細胞浸潤及纖維化程度。

免疫組化染色：采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化法（immunohistochemistry，IHC）檢測，二氨基聯苯胺顯色，一抗SERCA的工作濃度為1∶800，操作流程按試劑說明書進行。

Western blotting檢測肝臟組織內SERCA1/2/3蛋白的表達：取-80 ℃保存的肝臟組織加入到10 倍體積pH 7.4的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，用電動勻漿器制備肝勻漿，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min后，取上清液進行蛋白定量后檢測。圖像掃描和分析采用美國UVP公司凝膠成像系統及分析軟件。

1.3.2.2 肝細胞中Ca2+含量的測定

采用火焰原子吸收法測定細胞內Ca2+含量[5]。

1.3.2.3 肝臟組織TNF-α水平測定

采用酶聯免疫法按照試劑盒說明測定肝勻漿中TNF-α含量。

1.3.2.4 肝臟組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性測定

采用定磷法測定，按試劑盒說明書操作。ATPase活性以每小時每毫克組織蛋白中ATPase分解ATP產生1 μmol無機磷的量作為一個ATPase活力單位/（μmol/（mg·h））。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 肝臟組織病理學改變

2.1.1 常規HE染色

參照前期研究結果[2]，證實HC組大鼠肝質量及肝指數最大，肝小葉內可見明顯的大泡樣脂肪變性，彌漫分布，另見少量炎細胞浸潤，脂肪變性程度顯著強于其他組，說明造模成功。

2.1.2 免疫組化染色

圖1 大鼠肝臟中SERCA1/2/3蛋白定位表達（IHC，×400）Fig.1 Expression of SERCA1/2/3 in liver (IHC, ×400)

喂養結束后取各組大鼠部分肝臟組織做免疫組化染色，檢測肝臟內SERCA蛋白表達情況。如圖1所示，SERCA蛋白表達主要位于肝細胞胞漿內，NC組SERCA蛋白呈棕黃色細顆粒狀，均勻分布；HC組陽性細胞數明顯減少，著色強度減弱，且胞漿內可見脂肪空泡；TC組肝小葉中央靜脈周圍可見少量陽性細胞；而經富硒綠茶干預后的SeC組肝細胞內可見棕黃色陽性細胞量增多，彌漫分布，染色強度亦增加，說明蛋白表達增強。

2.1.3 Western blotting檢測蛋白表達情況

圖2 肝臟SERCA1/2/3蛋白表達Fig.2 Expression of SERCA1/2/3 in liver

由圖2可知，各組大鼠肝臟內均可見SERCA蛋白表達，但蛋白條帶灰度值有差異，重復實驗3 次以上結果做統計學分析（圖2b），HC組大鼠肝臟內蛋白量極顯著低于NC組（P＜0.01）；SeC組較HC組蛋白表達量顯著增加（P＜0.05）；而TC組與HC組相比差異無統計學意義，說明飲用普通綠茶水在增加肝臟組織SERCA蛋白表達量上無明顯作用。

2.2 肝臟內Ca2+、TNF-α含量變化

表1 肝臟內Ca2+、TNF- 含量變化（x ＝8）Table1 Ca2+ and TNF- levels in liver (x , = 8)

由表1可知，與NC組相比，HC組肝細胞內Ca2+含量明顯升高，而TC組和SeC組經干預后Ca2+含量均降低，差異顯著（P＜0.05），SeC組作用更明顯（P＜0.05）；HC組肝臟組織內TNF-α水平明顯高于NC組，富硒綠茶干預后其含量降低，效果優于TC組（P＜0.05）。說明富硒綠茶在降低肝臟內Ca2+含量及改善肝損傷方面較普通綠茶效果更明顯。

2.3 肝臟組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性的變化

表2 肝臟組織內Na -K -ATPase、Ca2+-ATPase活性變化（x ＝8）Table2 Activities of Na -K -ATPase and Ca2+-ATPase in liver (x , = 8)

由表2可知，HC組大鼠肝臟Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性下降，富硒綠茶干預后，SeC組2 種酶活性均明顯升高，差異極顯著（P＜0.05）；而且與普通綠茶相比，富硒綠茶更能提高Ca2+-ATPase活性（P＜0.05）。

3 討 論

NAFLD目前已成為導致無癥狀性轉氨酶升高的首要病因[6]，后期可進展為肝硬化。外源性高脂飲食使血清游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）增加，肝臟對NEFA攝取的增加使線粒體β氧化速度代償性增加，進而增加反應性氧產物的產出，反應性氧產物與膜磷脂的不飽和脂肪酸反應形成脂質過氧化，而且隨著脂質過氧化反應的加劇，肝細胞形態和功能的損傷程度加重[7]，當活性氧化的產生超過體內抗氧化系統的清除能力時，便產生氧化應激導致脂質過氧化損傷，使枯否細胞激活并釋放腫瘤壞死因子等炎性細胞因子和遞質，引起脂肪性肝炎甚至肝硬化[8-9]。本課題組前期通過高脂飲食已經成功誘導出NAFLD模型，模型組大鼠體質量及肝臟質量明顯增加，血脂及肝臟脂肪化程度均明顯增高，富硒綠茶干預后能有效降低高脂飲食誘導的大鼠肝臟脂肪變性程度[2]，亦證實氧化應激、脂質過氧化與NAFLD的發病存在某種聯系，這與國內外某些文獻報道一致[10]。

線粒體功能明顯異常，既是NAFLD的結果也是導致進一步損傷的重要環節[11]。脂肪肝病時由于ATP生成減少，Na+-K+-ATPase活性降低可導致肝細胞損傷[12]。Ca2+-ATPase是維持細胞內Ca平衡的重要物質，其活性下降使線粒體Ca泵向細胞外排Ca作用減弱，線粒體內Ca超載是線粒體氧化磷酸化障礙、結構受損和細胞壞死的重要原因[13]。SERCA能夠逆濃度梯度將細胞質中的Ca2+轉運至內質網中從而降低細胞質中的Ca2+濃度，這對于Ca信號和細胞增殖具有重要的作用[14]。SERCA有3 種亞型，不同組織和種屬存在不同亞型，大鼠肝臟表達SERCA 2b和SERCA 3兩種亞型[15-16]。本實驗發現NAFLD大鼠肝臟組織中Ca2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性及蛋白表達均顯著下降，Ca含量明顯升高，出現Ca超載現象，這可能與氧自由基產生增加，導致膜脂質過氧化，使膜通透性改變，細胞外Ca2+內流，同時細胞Ca2+-ATPase失活，胞內Ca外流障礙，Na+-K+-ATPase失活，胞內Na+含量增加，刺激Na+-Ca2+交換，使Ca2+內流增加，加劇了Ca超載。富硒綠茶干預可以明顯提高NAFLD大鼠肝臟組織中谷胱甘肽過氧化物酶[2]、Ca2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性，增強總SERCA蛋白表達，有效阻抑丙二醛[2]和Ca2+含量的升高。另外，發生脂肪肝時肝臟內TNF-α水平明顯增高，提示可能存在肝損傷及炎癥反應，通過肝臟組織病理學檢查也證明存在炎癥及肝細胞壞死；也有研究表明TNF-α可以通過增強自由基的產生和脂質過氧化等方面促進脂肪性肝炎的發生[17-18]，富硒綠茶干預后TNF-α水平降低，且比普通綠茶效果更加明顯。富硒綠茶保護肝損傷的機制可能是茶多酚增強脂肪肝大鼠自由基代謝作用，對ATPase活性下降和組織Ca超載有阻抑作用。因為天然抗氧化劑茶多酚是從茶葉中提取的一種多酚類物質，結構中富含酚羥基，可提供活潑氫使自由基滅活，而本身被氧化形成的自由基由于含鄰苯二酚結構而具有較高穩定性，具有抗氧化、保護生物膜及調節組織Ca2+含量等廣泛的生物學作用，研究證實其抗氧化效果比VE、VC高出20 倍[19]；也可能是硒作用所致，王玉珍等[20]認為硒可以增加細胞膜、肌漿網Ca泵的活性，防止細胞內Ca2+超載；缺硒也可能通過過氧化損傷導致細胞內Ca2+超載[21]。由此推測富硒綠茶可能是通過降低脂肪肝病大鼠肝臟內Ca2+含量、維持細胞內Ca穩態、降低肝細胞炎癥反應、提高Ca2+-ATPase活性、增強肝臟總SERCA表達，進而改善大鼠肝臟能量代謝障礙，達到干預NAFLD發生發展的目的。

SERCA表達情況還和細胞的種類、生長狀態等均有關，而且SERCA的活性不僅和表達量有關，還受機體代謝等方面的影響。那么在NAFLD中氧自由基的堆積、Ca2+超載與SERCA表達之間的關系及有無相互作用，以及調控機制如何，還有待進一步實驗研究。

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Effect of Selenium-Enriched Green Tea on Activity and Expression of Sarco(endo)Plasmic Reticulum Ca2+-ATPase
(SERCA) in Rats with Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD)

WANG Feng-jie1,2, CHEN Xian-bing1,2,*, ZHANG Shu-yu2, TAN Zhi-xin2, XIANG Guo-min2, LIU Jin-hong2
(1. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China; 2. Science and Technology College of Hubei Minzu University, Enshi 445000, China)

Objective: To investigate the effect of selenium-enriched green tea on the activity and expression of sarco(endo) plasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) on model rats with experimental non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and explore the possible mechanisms for the prevention and treatment of NAFLD. Methods: Totally 32 Wistar rats were divided into 4 groups randomly and fed with standard diet and water (NC), high-fat diet and water (HC), high-fat diet and tea (TC), high-fat diet and selenium-enriched tea (SeC), respectively. After 9 weeks, the rats were killed to investigate the changes in Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase activities. Meanwhile, hepatic tumor necrosis factor-α (TNF-α) and Ca2+levels and the protein expression of SERCA in hepatocytes was evaluated by immunohistochemistry (IHC) and Western blotting. Results: The protein expression of SERCA and the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were significantly decreased and the Ca2+level was remarkably increased in HC group. The activity and expression of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in liver were markedly upregulated in intervention group. On the contrary, the level of Ca2+in SeC group was greatly reduced when compared with ordinary tea. Conclusion: Selenium-enriched green tea can improve hepatic energy metabolism disorder, protect liver function, and prevent liver damage in NAFLD rats.

selenium-enriched green tea; nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD); sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)

R285.5

A

1002-6630（2014）21-0219-04

10.7506/spkx1002-6630-201421043

2014-01-22

生物資源保護與利用湖北省重點實驗室項目（PKLHB1308）；湖北民族學院科技學院科研項目（KY201410）

王鳳杰（1981—），女，講師，碩士，研究方向為微量元素與健康。E-mail：625958220@qq.com

*通信作者：陳顯兵（1976—），男，副教授，碩士，研究方向為微量元素與健康。E-mail：chenxianbing7612@163.com