鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵的菌株優(yōu)選

崔小利，王 薇，闞建全,3,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），重慶 400715）

鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵的菌株優(yōu)選

崔小利1,2，王 薇1,2，闞建全1,2,3,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），重慶 400715）

通過(guò)對(duì)市售鲊?yán)苯窐悠分形⑸锏姆蛛x、鑒定，確定鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中的主發(fā)酵菌；再購(gòu)買常用的幾種發(fā)酵菌，通過(guò)其在最適條件下的產(chǎn)酸性和還原糖利用率等對(duì)菌株進(jìn)行初篩；在初篩的基礎(chǔ)上，再在實(shí)際生產(chǎn)中用產(chǎn)酸性、氨基酸態(tài)氮的生成和發(fā)酵成品的感官評(píng)分實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩。結(jié)果表明：鲊?yán)苯纷匀话l(fā)酵過(guò)程中的主發(fā)酵菌是乳酸菌，純種發(fā)酵的合適菌種是植物乳桿菌。純種發(fā)酵彌補(bǔ)了傳統(tǒng)自然發(fā)酵穩(wěn)定性差，生產(chǎn)周期長(zhǎng)等不足，可為實(shí)現(xiàn)鲊?yán)苯樊a(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

鲊?yán)苯罚患兎N發(fā)酵；菌株篩選

鲊?yán)苯肥谴ā⒍酢⑾妗⑶鹊貐^(qū)的一種傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品，它以新鮮的紅辣椒和玉米粉為主要原料，經(jīng)過(guò)一個(gè)月左右的自然發(fā)酵形成。因其口感微酸微辣、香氣特殊、回味醇厚等特點(diǎn)備受親睞。辣椒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，不僅能增強(qiáng)食欲，防止動(dòng)脈粥樣硬化，還具有多種保健功能[1-5]。傳統(tǒng)鲊?yán)苯芬约彝プ鞣皇綖橹鳎l(fā)酵采用自然開放式，參與發(fā)酵微生物來(lái)源于空氣、水和使用的工具等，是一種多菌種混合發(fā)酵，并受季節(jié)、區(qū)域影響，且發(fā)酵周期較長(zhǎng)，菌種、接種量、溫度等的差異都會(huì)造成鲊?yán)苯返钠焚|(zhì)和風(fēng)味不同，使得產(chǎn)品的質(zhì)量不穩(wěn)定，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，影響了鲊?yán)苯返漠a(chǎn)業(yè)化發(fā)展[6]。眾多研究者提出可以通過(guò)純種發(fā)酵解決上述問(wèn)題[7-9]，純種發(fā)酵能使有益菌快速生長(zhǎng)代謝，過(guò)程簡(jiǎn)單、易控，還會(huì)減少一些有害產(chǎn)物的積累[10]。目前，對(duì)于鲊?yán)苯返难芯恐饕獓@鲊?yán)苯纷匀话l(fā)酵過(guò)程中的各物質(zhì)的消長(zhǎng)變化[11-12]，也有少數(shù)學(xué)者研究過(guò)混合發(fā)酵工藝[13]，但鲊?yán)苯返募兎N發(fā)酵研究還未見報(bào)道。因此，本研究擬首先分析自然發(fā)酵鲊?yán)苯樊a(chǎn)品中的微生物種類、比例，根據(jù)其發(fā)酵機(jī)制，確定各微生物菌群在發(fā)酵過(guò)程中所起的作用，選購(gòu)合適的目的菌種，再對(duì)鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行初步探索，以期為鲊?yán)苯返募兎N發(fā)酵技術(shù)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

市售鲊?yán)苯窐悠罚少?gòu)于貴州省遵義市的超市或農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，散裝稱質(zhì)量，樣品編號(hào)及名稱見表1。樣品采購(gòu)后均密封后貯存于4 ℃的冰箱中保存。

表1 1 鲊?yán)苯窐悠沸畔⒈鞹able1 Details of commercial Zhalajiao used in this study

1.2 試劑與菌種

玉米粉、食鹽 重慶市北碚區(qū)永輝超市；氫氧化鈉天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；甲醛、3,5-二硝基水楊酸、亞硝酸鈉 成都市科龍化工試劑廠；硝酸銀 天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂等 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；所有試劑均為分析純。

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、乳鏈球菌（Streptococcus lacticus）、腸膜明串珠菌（Leuconstoc meseteroides）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）6001、嗜熱乳鏈球菌（S. thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus） 中國(guó)科學(xué)院菌種保藏中心。

1.3 儀器與設(shè)備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；722-P可見分光光度計(jì) 上海現(xiàn)科儀器有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；PB-10 Sartorius酸度計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH.B11-600-S恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.4 方法

1.4.1 市售鲊?yán)苯窐悠分形⑸锏姆蛛x和鑒定

采用選擇培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基（分離乳酸菌）、醋酸菌培養(yǎng)基（分離醋酸菌）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（分離酵母菌）、高氏培養(yǎng)基（分離放線菌）、察氏培養(yǎng)基（分離霉菌）對(duì)市售的鲊?yán)苯窐悠愤M(jìn)行微生物分離、篩選[14]。

參照GB4789.2—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》，采用平板法測(cè)定各種選擇培養(yǎng)基上的菌落總數(shù)，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)[15]。

1.4.2 乳酸菌發(fā)酵液的制備

根據(jù)樣品中微生物的分離和鑒定結(jié)果確定出鲊?yán)苯返闹靼l(fā)酵菌，然后以購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院菌種保藏中心的主要工業(yè)發(fā)酵菌種作為待篩選的菌種，并測(cè)定其生產(chǎn)性能。

乳酸菌發(fā)酵液的制備[16-17]：取乳酸菌保藏菌種2 環(huán)→斜面活化（48 h）→再取2 環(huán)于液體MRS培養(yǎng)基中再活化（48 h）→接入500 mL液體MRS培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)→乳酸菌發(fā)酵液（冷藏保存?zhèn)溆茫?/p>

1.4.3 待測(cè)菌在MRS培養(yǎng)基上的初篩實(shí)驗(yàn)

吸取待測(cè)乳酸菌發(fā)酵液5 mL，接種于MRS液體培養(yǎng)基100 mL中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，每隔6 h測(cè)定一次MRS 培養(yǎng)基中的pH值[18]、總酸含量[19]、還原糖含量、OD580nm值。

pH值的測(cè)定參照GB10468—1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測(cè)定方法》，用酸度計(jì)測(cè)定；總酸的測(cè)定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》，采用中和滴定法，結(jié)果以乳酸計(jì)；還原糖的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法，結(jié)果以葡萄糖計(jì)。

1.4.4 待測(cè)菌在實(shí)際生產(chǎn)原料中的復(fù)篩實(shí)驗(yàn)

根據(jù)初篩結(jié)果選擇4 種乳酸菌，取其發(fā)酵菌液5 mL，接種到原料（m（辣椒）∶m（玉米）=1∶1）中，添加輔料混勻后于30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，每天測(cè)一次樣品中的pH值、總酸、氨基酸態(tài)氮含量[20]。

氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定參照GB/T5009.40—2003《醬衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》，采用甲醛滴定法。

1.4.5 純種發(fā)酵與自然發(fā)酵的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究[21]

根據(jù)復(fù)篩結(jié)果選出的最優(yōu)菌在最適條件下進(jìn)行純種發(fā)酵所得的鲊?yán)苯樊a(chǎn)品與市售鲊?yán)苯樊a(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)定，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表 22 鲊?yán)苯返母泄僭u(píng)定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table2 Criteria for sensory evaluation of Zhalajiao

感官評(píng)定方法[22]：采用100 分制（評(píng)分項(xiàng)目為4 項(xiàng)5 個(gè)等級(jí)，每項(xiàng)占25 分）。請(qǐng)10 位有經(jīng)驗(yàn)的食品專家和10 位消費(fèi)者（非專業(yè)人員）按感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)鲊?yán)苯窐悠愤M(jìn)行評(píng)分，取平均分作為最終評(píng)分。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，并用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售鲊?yán)苯窐悠分形⑸锏姆蛛x和鑒定

表3 3 鲊?yán)苯窐悠分形⑸锏臏y(cè)定結(jié)果Table3 Strains isolated from Zhalajiao

由表3可知，所有樣品中都沒(méi)有放線菌檢出；霉菌在部分樣品（A、B、C）中檢出，這可能是鲊?yán)苯樊a(chǎn)品在銷售過(guò)程中被雜菌污染所致。樣品D購(gòu)于超市中，可能經(jīng)過(guò)了滅菌處理，沒(méi)有待測(cè)菌檢出。鲊?yán)苯纷匀话l(fā)酵中的有效菌是乳酸菌、酵母菌、醋酸菌，3 類菌數(shù)量不同，但差異不大，都在同一數(shù)量級(jí)。其中乳酸菌數(shù)量最高的是G樣品為8.1×107CFU/g，最低的是A樣品為6.8×107CFU/g，但A樣品中霉菌含量較高，可能是由于放置時(shí)間較長(zhǎng)，乳酸菌已經(jīng)衰減并且感染了霉菌等雜菌。就各種菌的菌落總數(shù)而言，乳酸菌、酵母菌、醋酸菌的比例大約是7∶3∶4，乳酸菌占有比例最大，發(fā)揮著發(fā)酵產(chǎn)酸的主要作用，而醋酸菌和酵母菌在自然發(fā)酵中起促進(jìn)風(fēng)味形成的作用。

在下面菌株篩選實(shí)驗(yàn)中，擬選擇乳酸菌作為純種發(fā)酵菌株，而工業(yè)上常用的蔬菜發(fā)酵乳酸菌種主要有：干酪乳桿菌、乳鏈球菌、腸膜明串株菌、短乳桿菌和植物乳桿菌。由于保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，是酸乳重要的發(fā)酵菌種。因此，選擇這7 種乳酸菌作為待選菌種進(jìn)行篩選，并依次編號(hào)記為：L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7。

2.2 待測(cè)菌在MRS培養(yǎng)基上的初篩實(shí)驗(yàn)

由圖1、2可知，所有乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中均能產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基pH值下降、總酸增加。其中L1、L2、L3的產(chǎn)酸能力較低，L3在48 h時(shí)pH值達(dá)到5.20，總酸（以乳酸計(jì)）是0.48%；L4、L5、L6、L7產(chǎn)酸能力都比較高，48 h時(shí)pH值均低于4.5，產(chǎn)總酸大于1.30%。其中L5、 L6產(chǎn)酸量較高，均達(dá)到了1.77%，產(chǎn)酸量最高的L7達(dá)到了1.84%。因此，依據(jù)產(chǎn)酸能力和發(fā)酵能力，L4、L5、L6、L7可作為工業(yè)發(fā)酵菌種。

圖1 MRS培養(yǎng)基中pH值的變化Fig.1 pH changes in MRS medium during culture of lactic acid bacteria

圖2 MRS培養(yǎng)基中總酸的變化Fig.2 Changes in total acid content (calculated as lactic acid) in MRS medium during culture of lactic acid bacteria

圖3 MRS培養(yǎng)基中還原糖含量的變化Fig.3 Changes in reducing sugar content (expressed as glucose) in MRS medium during culture of lactic acid bacteria

由圖3可知，這7 種乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中對(duì)還原糖的利用率有較大差異，其中L1、L2、L3在48 h內(nèi)還原糖（以葡萄糖計(jì)）含量降低少，說(shuō)明這3 種菌還原糖利用率較低。而L4、L5、L6、L7的還原糖利用率相對(duì)較高。L5的還原糖含量從最初的7.6%經(jīng)過(guò)48 h后驟減至0.68%，L6的還原糖消減量與L5相當(dāng)，但L5最先開始快速利用還原糖。與此相比，L4和L7還原糖消減較少。結(jié)合圖1和圖2得出，這幾種乳酸菌的產(chǎn)酸能力與還原糖利用率成正比。考慮到鲊?yán)苯返陌l(fā)酵原料（辣椒和玉米）中還原糖含量有限，因此還原糖利用率也是篩選鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵菌的關(guān)鍵因素。

圖4 MRS培養(yǎng)基中乳酸菌OODD58800nnmm值的變化Fig.4 Changes in cell density (expressed as OD580nm) during culture of lactic acid bacteria in MRS medium

由圖4可知，乳酸菌L1、L2、L3生長(zhǎng)緩慢，而乳酸菌L4、L5、L6、L7生長(zhǎng)速率和繁殖生長(zhǎng)力較高，其中L5在12～30 h的OD580nm值由0.117變化到0.468，可認(rèn)為這段時(shí)間乳酸菌L5處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體數(shù)量增加最快，30 h后則進(jìn)入穩(wěn)定期生長(zhǎng)趨于平緩。乳酸菌L4、L6、L7相對(duì)L5進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間較晚，約從24 h后開始，但L6的OD580nm值在48 h時(shí)最高為0.532。乳酸菌L4和L7生長(zhǎng)速率較緩慢，其最終OD580nm值分別為0.430和0.480。

由圖1～4可知，乳酸菌L1、L2和L3的生長(zhǎng)能力、產(chǎn)酸性和發(fā)酵性能均較低，不適合作為純種發(fā)酵的菌種。而L4、L5、L6、L7的產(chǎn)酸力和生長(zhǎng)能力均較強(qiáng)，其中L5在生長(zhǎng)速率上最快，L6最終繁殖生長(zhǎng)量最高；L5、L6和L7產(chǎn)酸能力差異較小；L5、L6和L7的還原糖利用率較大，因此，將乳酸菌L1、L2、L3淘汰，選取乳酸菌L4、L5、L6、L7接種在實(shí)際生產(chǎn)原料中再次篩選。

2.3 待測(cè)菌在實(shí)際生產(chǎn)原料中的復(fù)篩實(shí)驗(yàn)

圖5 實(shí)際生產(chǎn)原料中pH值的變化Fig.5 pH changes in the raw materials during fermentation with screened strains

圖6 實(shí)際生產(chǎn)原料中總酸含量的變化Fig.6 Changes in total acid content (calculated as lactic acid) in the raw materials during fermentation with screened strains

由圖5、6可知，接種乳酸菌的鲊?yán)苯钒l(fā)酵組（L4、L5、L6、L7）與自然發(fā)酵組（L0）相比，其pH值下降速率更快、產(chǎn)酸量更多。在發(fā)酵開始時(shí)，所有發(fā)酵組的pH值在6.80左右相差不大，發(fā)酵5 d后L0的 pH值降為5.37，而接種乳酸菌的鲊?yán)苯钒l(fā)酵組的pH值則降到4.2左右，其中接種了乳酸菌L5的鲊?yán)苯钒l(fā)酵組的pH值最低為3.81。接種乳酸菌L4、L5、L6、L7的鲊?yán)苯吩诎l(fā)酵4 d時(shí)總酸含量（以乳酸計(jì)）達(dá)到0.94%以上，發(fā)酵5 d時(shí)總酸含量上升至1.1%左右，此段時(shí)間總酸含量增長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酸量少，說(shuō)明純種發(fā)酵已成熟，但L0在5 d時(shí)總酸含量很低（0.43%）。因此，從產(chǎn)酸性來(lái)看，L5更適合作為鲊?yán)苯返募兎N發(fā)酵菌。

圖7 實(shí)際生產(chǎn)原料中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.7 Changes in amino acid nitrogen content in the raw materials during fermentation with screened strains

氨基酸態(tài)氮是判定發(fā)酵產(chǎn)品發(fā)酵程度的特性指標(biāo)，該指標(biāo)越高，說(shuō)明產(chǎn)品中的氨基酸含量越高。由圖7可知，L0發(fā)酵5 d時(shí)氨基酸態(tài)氮含量為0.12%，接種了乳酸菌L5的氨基酸態(tài)氮含量最高為0.31%，L4、L6、L7則相對(duì)低些，分別為0.28%、0.27%和0.28。L5的氨基酸態(tài)氮增長(zhǎng)速率一直較快，發(fā)酵到第4天時(shí)其含量已達(dá)到0.30%。鲊?yán)苯吩诎l(fā)酵成熟后的貯存過(guò)程中氨基酸態(tài)氮會(huì)增加，但量較少。因此，L5更適合作為鲊?yán)苯返陌l(fā)酵菌。

2.4 純種發(fā)酵鲊?yán)苯返母泄僭u(píng)定

表4 乳酸菌純種發(fā)酵鲊?yán)苯窐悠返母泄僭u(píng)分Table4 Sensory evaluation of Zhalajiao fermented with lactic acid bacteria

由表4可知，所有樣品外觀和組織的感官評(píng)分相差不大，這是由于所有樣品的原料和前處理是相同的，但樣品在滋味氣味和口感方面評(píng)分結(jié)果相差較大。自然發(fā)酵組L0最低，原因是在發(fā)酵5 d時(shí)，其產(chǎn)酸量和氨基酸態(tài)氮含量還很低，發(fā)酵很不成熟，仍具有玉米生腥味及辣椒的鮮辣刺激味，鲊?yán)苯诽赜械娘L(fēng)味還未形成，在風(fēng)味和口感上都還屬于沒(méi)發(fā)酵好的產(chǎn)品，故其總分值最低。接種乳酸菌的鲊?yán)苯方M在發(fā)酵5 d時(shí)，其總酸含量和氨基酸態(tài)氮含量已較高，在風(fēng)味上已無(wú)玉米的生腥味，且有明顯的酸辣味，與自然發(fā)酵鲊?yán)苯烦善废嗖畈淮螅↙A、LB、LC是3 種自然發(fā)酵完全的鲊?yán)苯罚Ｆ渲蠰5的總分值最高。

3 結(jié) 論

市售成品鲊?yán)苯返奈⑸锓蛛x鑒定表明乳酸菌為鲊?yán)苯返闹饕l(fā)酵菌種；選用7 種工業(yè)常用乳酸菌（干酪乳桿菌、乳鏈球菌、腸膜明串珠菌、短乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱乳鏈球菌和保加利亞乳桿菌）作待測(cè)菌，通過(guò)在MRS培養(yǎng)基初篩和在實(shí)際生產(chǎn)鲊?yán)苯吩仙系膹?fù)篩，確定了植物乳桿菌可作為鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵的菌株。

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Screening Strains for Use in Pure Culture Fermentation for the Production of Zhalajiao, a Traditional Chinese Fermented Hot Pepper Product

CUI Xiao-li1,2, WANG Wei1,2, KAN Jian-quan1,2,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Key Laboratory of Agro-products Processing and Storage of Chongqing, Chongqing 400715, China; 3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

The dominant strains involved in the fermentation of a mixture of hot pepper with corn flour to produce Zhalajiao, a traditional Chinese fermented hot pepper product were isolated from commercial Zhalajiao samples and identified as lactic acid bacteria. Primary screening of seven species of lactic acid bacteria was conducted for acid production and reducing sugar utilization under optimal culture conditions, and their abilities to produce acid and amino acid nitrogen as well as sensory evaluation of the final products fermented with each strain were measured for secondary screening. Lactobacillus plantarum was suitable for the pure culture fermentation of Zhalajiao. The disadvantages of the traditional natural fermentation such as poor stability and long production period could be compensated by using the pure culture fermentation. This study may provide useful references for the industrial production of Zhalajiao.

Zhalajiao; pure culture fermentation; strain screening

TS205.5

A

1002-6630（2014）21-0149-05

10.7506/spkx1002-6630-201421029

2013-11-17

國(guó)家重大星火計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011GA811001）

崔小利（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：lily67210@163.com

*通信作者：闞建全（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)、食品生物技術(shù)、食品質(zhì)量與安全。E-mail：ganjq1965@163.com