栓菌漆酶的異源表達及重組酶碳端和氮端組氨酸標簽修飾對酶學特性的影響

劉英麗，劉駿明，王 靜，孫寶國,*，THIERRY Tr on

（ 1.北京工商大學 食品質量與安全北 京實驗室，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048；2.Aix Marseille Université, CNRS, iSm2 UMR 7313, Marseille, France 13397）

栓菌漆酶的異源表達及重組酶碳端和氮端組氨酸標簽修飾對酶學特性的影響

劉英麗1，劉駿明1，王 靜1，孫寶國1,*，THIERRY Tr on2

（ 1.北京工商大學 食品質量與安全北 京實驗室，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048；2.Aix Marseille Université, CNRS, iSm2 UMR 7313, Marseille, France 13397）

以來源Trametes sp.C30 的LAC3漆酶基因為研究對象，通過引物設計進行突變，在其C端和N端進行延長，分別引入6 個組氨酸標簽，并異源表達于釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中，將獲得的重組酶進行比較發現漆酶末端氨基酸序列的改變對酶學性質的影響較大。C端引入組氨酸標簽的重組酶的表達量不受影響，但是在N末端引入組氨酸標簽的重組酶表達量只有LAC3的一半。添加組氨酸標簽的融合蛋白對ABTS和SGZ兩種底物的親和力得到增強。而在酸堿穩定性耐受方面，與LAC3相比，N末端氨基酸的改變使其在酸堿穩定性方面得到了增強，中堿性條件下仍能保持較佳活性。C端和N端可塑性的研究對于漆酶新性狀的獲得具有重要意義。

漆酶；異源表達；組氨酸標簽；碳端；氮端

漆酶（EC1.10.3.2）是一種含銅的多酚類氧化還原酶，最早于1883年從日本的漆樹（Rhus vernicifera）汁液中發現，屬藍多銅氧化酶（blue multicopper oxidase， BMCOs）家族[1]。其廣泛分布于自然界的昆蟲、高等植物、真菌和細菌中，特別在大型真菌如擔子菌、子囊菌和半知菌中發現較多。不同來源的漆酶，其結構、性質是不同的，典型的漆酶含有3 個結構域，活性中心含4 個銅離子，由于銅離子獨有的氧化還原能力漆酶具寬泛的底物專一性，能催化多種酚類和芳香類化合物發生氧化直接生成水，基于此綠色特性，漆酶的應用非常廣泛，目前的研究還主要集中在工業廢水廢料處理、紡織染料漂白[2]、紙漿木質素去除[3]、土壤和水的生物修復、生物燃料電池[4-6]和生物傳感器[7-8]等方面。漆酶在食品工業中的應用比較有限，主要是利用漆酶氧化酚類底物的性質解決果汁和果酒中的沉淀問題[9]；另外，利用漆酶的氧化性以及漆酶與面粉中的阿魏酸能形成凝膠兩者共同作用的特點，將漆酶應用于面制品中可以使饅頭的品質有較大的提升，使其外觀更白、結構更細密均勻、體積變大、富有彈性、鎖住更多的水分[10]。隨著研究的深入，漆酶在農產品加工改性、食品制造中的應用價值將被進一步挖掘激發出來，這也對漆酶的性質提出了更多的要求，例如高的氧化還原電勢、中堿性條件下仍能保持最佳活性、較好的熱穩定性等。然而，天然存在單一漆酶無法滿足這些條件，因此尋找具有新特性的漆酶十分必要。

作為含有3 個結構域的具有催化活性的蛋白， 通過突變來研究漆酶結構和功能的關系了解漆 酶結構的可塑性是最常見的手段。許多研究結果表明了靠近活性中心特定位置的氨基酸與催化活性的關系，Solomon等[11-13]的研究小組作為先驅早在20世紀90年代就做了大量的工作，對活性中心氨基酸的定點突變與催化效率及電動勢的關系做了詳盡的研究。更有學者通過較大幅度的變化如結構域的互換來獲得新性狀的漆酶，Yuko等[14]將來源Lentinula edodes的不同漆酶lac1和lac4的結構域進行重組，并在煙草細 胞中表達獲得了比親本更寬底物專一性的重組酶；Viviane等[15]將來源Trametes sp.C30漆酶的兩個同工酶lac1和lac3結構域進行重組，獲得的重組酶在降解藍色蒽醌染料AB64上有較好效果。而C末端和N末端的加工作用對漆酶正確折疊的指導作用近年來也引起人們的極大興趣，不同來源的漆酶其末端的加工作用差別很大。在子囊菌漆酶中，如熱白絲菌漆酶MaL[16]和嗜熱毀絲菌漆酶MtL[17]及粗糙脈孢菌[18]和柄孢霉[19]菌株中均發現C末端的修飾作用直接影響漆酶的活性，通過對熱白絲菌漆酶MaL/rMaL[16,20]和沙生梭孢殼菌漆酶TaLcc1[21]晶體結構的分析發現，C末端的最后4 個殘基Asp-Ser-Gly-Leu（DSGL）會在通向漆酶三核中心的通道中形成一個塞子，從而堵住了可能存在的氧氣通道。因此，子囊菌中的C末端羧酸可能作為氧氣還原成水的質子傳遞供體，從而影響蛋白的反應活性[22]。目前，C末端的重要作用在子囊菌漆酶中體現較為顯著，而在漆酶來源非常廣泛的擔子菌中的作用尚未有界定，關于N端作用的研究也甚少。將獲得的擔子菌屬栓菌漆酶序列通過3D模型進行結構模擬（如圖1所示，結構示意圖由Swiss Pdbviewer軟件繪制）可以看出僅僅對末端進行定點突變可能意義不是很大，一定幅度的截平或者延長末端對擔子菌漆酶結構和性質會有什么樣的影響？本實驗以擔子菌漆酶Trametes sp. C30為研究對象，克隆得到漆酶基因lac3，利用突變的技術將其C端和N端延長，融合一個含有6 個組氨酸的標簽，PEG/LiAc法轉化釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，并進行蛋白的純化。通過對重組酶特性的研究，探討擔子菌漆酶C端和N端的延長對漆酶功能活性的影響。選擇6 個組氨酸做標簽進行延長，一方面是出于純化的考慮，另一方面6 個組氨酸標簽具有良好的金屬螯合能力，可用于將酶分子定向固定在金屬電極的表面形成自組裝單層膜，有效地研究酶分子與底物間的電化學過程，為漆酶在生物電化學、生物傳感器、人工生物膜等領域的研究與應用提供一定的研究基礎。

圖1 來源于Trammeetteess sp.C30的漆酶3D結構模型Fig.1 3D structure model of laccase from Trametes sp. C30

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Trametes sp. C30菌株、表達載體釀酒酵母S. cerevisiae W30 3-1A由法國?？速愸R賽大學iSm2實驗室Tron博士提供；大腸桿菌E. coli DH5α 美國Promega公司；選擇培養基（1 L，無氨基酸酵母氮源培養基6.7 g、葡萄糖20 g、酪蛋白水解物5 g、腺嘌呤90 mg、色氨酸40 mg、琥珀酸鹽緩沖液50 mmol/L，pH 5.3，CuSO4100 μmol/L） 美國BD公司；QuikChange Sitedirected mutagenesis試劑盒 美國Stratagene公司；丁香醛連氮（syringaldazine，SGZ）、2,2-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2-azinobis（3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic acid）diammonium salt，ABTS） 美國Spectrum公司；Anti-his（C-term）-HRP抗體 美國Invitrogen公司。

1.2 儀器與設備

T100 PCR儀、電泳轉印系列 美國Bio-Rad公司；V18R離心機 澳大利亞Dynamica公司；Genova Nano微量核酸蛋白分析儀 英國Jenway公司；Ecotron恒溫搖床瑞士Infors公司；FPLC AKTA Purifier 100 美國GE公司；UV-2700紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 漆酶cDNA的克隆和突變體的構建

以總RNA為模板，按文獻[23]的方法合成lac3 cDNA（GenBank登記號AY397783），克隆載體pAK145構建參見Klonowska等[23]的方法。在lac3漆酶C端和N端引入一個含有6 個組氨酸標簽的融合蛋白，以pAK145為模板，采用QuikChange Site-directed mutagenesis kit進行定點突變，分別設計兩對引物：YL1 5’-GAA GCT GCT TCG CCT CTC AAT GAT GGT GGT GAT GGT GGC GCC CGA GAC CGT CGG G-3’ 和YL2 5’-CCC GAC GGT CTC GGG CGC CAC CAT CAC CAC CAT CAT TGA GAG GCG AAG CAG CTT C-3’；YL3 5'-GGT CAA GTC CGT GAC AGG TCC ATG GTG GTG GTG ATG GTG TAT TGC TGC AGA TAT TTG GG-3’ 和YL4 5'-CC CAA ATA TCT GCA GCA ATA CAC CAT CAC CAC CAC CAT GGA CCT GTC ACG GAC TTG ACC-3’。循環反應參數為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，68 ℃ 10 min，共15 個循環。

1.3.2 轉化釀酒酵母及漆酶的培養

聚乙二醇-醋酸鋰（P EG-LiAc）誘導的化學轉化法轉化釀酒酵母S. cerevisiae W303-1A，SD平板中添加體積分數為0.02%愈創木酚作為陽性轉化子的篩選指示劑。將獲得的突變體漆酶在28 ℃，120 r/min條件下搖瓶培養。

1.3.3 漆酶活性測定

在30 ℃條件下連續監測2 min內丁香醛連氮（syringaldazine，SGZ）的氧化速率，在1 mL pH 5.5 醋酸鹽緩沖體系中加入20 ?L SGZ（0.8 mg/mL），漆酶每分鐘每氧化1 μmol底物定義為1 個活力單位。

1.3.4 電泳條件及Western blotting雜交

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和 Native-PAGE分析蛋白的分離情況，后者不加入二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），不對樣品進行煮沸。為了探明漆酶在非變性條件下的活性，將Native-PAGE凝膠剝離后浸泡在20 mmol/L pH 3.6的醋酸鹽緩沖液中10 min，再通過添加了2 mg/mL的對苯二胺（p-phenylenediamine，PPD）進行染色，最后通過大量的水洗進行染色終止。漆酶抗體的獲得通過免疫兔子獲得多克隆抗體，抗原采用純化后的天然Trametes sp. C30漆酶，對于突變體漆酶由于6 個組氨酸標簽的融合，可使用Invitrogen公司的anti-his（C-term）-HRP抗體來對標簽進行識別。樣品通過SDS-PAGE來進行分離，電轉移將蛋白轉移至硝酸纖維素薄膜，二抗選用羊抗兔的抗抗體。

1.3.5 漆酶的純化

將菌株液體發酵約4 d產生的胞外漆酶，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心分離30 min獲得上清液，再通過微濾處理進行濃縮，對于無標簽的重組酶可將濃縮液上樣至DEAE-纖維素柱、Sephacryl S200進行層析，對于含有組氨酸標簽的蛋白可以直接將濃縮液通過Ni-NTA親和層析柱進行純化，最終得到電泳純蛋白。

1.3.6 pH值和溫度對酶活力的影響

重組漆酶最適pH值的測定是在Mcllvaine檸檬酸/磷酸鹽緩沖液中，其pH值范圍為2.2～9.0，漆酶的活性測定以SG Z為底物，測得的最大值作為100%。

pH值對酶穩定性影響的測定在室溫條件下于Mcllvaine緩沖液中進行，測定在不同pH值條件下重組漆酶2、4、8、24 h的活性。溫度對酶穩定性影響的測定是在不 同溫度條件下（30、40、50 ℃）將酶在100 mmol/L pH 5.5的醋酸鹽緩沖液中孵育2 h，每間隔15 min測一次酶活力。

2 結果與分析

2.1 突變體漆酶序列的確定

通過與lac3序列比對，可以確認突變體漆酶的C端和N端成功融合了6 個組氨酸標簽，部分序列比對結果如圖2所示，框內為融合的組氨酸標簽。

圖2 重組酶序列比對結果Fig.2 Sequence alignment of recombinant enzymes

2.2 陽性重組子產酶性質分析

平板中以添加愈創木酚為篩選標記，將能夠產生紅色暈圈的重組子挑選出來，在液體培養基中培養。發現隨著培養時間的延長，在4～5 d左右重組漆酶活性達到最高峰，之后開始下降。C端和N端融合6 個組氨酸標簽后對漆酶活力影響較大，但是考慮到胞內蛋白分泌量不同的影響，以比活力的計算來衡量融合標簽后重組酶的特性更加有說服力。在最高峰t=120 h時，不添加標簽的漆酶比活力為45 U/mg，C端和N端添加標簽的重組酶比活力分別是24、20 U/mg。

將漆酶活力最高峰時的發酵液離心提取上清液后進行SDS-PAGE（凝膠銀染）和Native-PAGE電泳，結果如圖3所示。

圖3 重組酶發酵液上清蛋白電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of recombinant laccase in culture supernatants

由圖3A可知，同不轉入載體的陰性對照W303-1A相比，其他3 個重組酶在90 kD左右有一條明顯的條帶，而純化后的LAC3對應的大小也是90 kD，可以分析得知重組后的漆酶表觀分子質量在90 kD左右，比起理論分析值53 kD要高出許多，這可能是由于釀酒酵母做表達系統使漆酶的糖基化程度加重。由圖3B可以看出，與陰性對照相比，3 個重組酶均有漆酶活性。

2.3 重組漆酶的純化

對于LAC3重組酶的純化采用兩步層析法，添加了組氨酸標簽的融合蛋白可以采用一步法通過Ni-NTA柱進行純化，純化后的蛋白上樣進行SDS-PAGE和Western blotting分析，結果如圖4所示。純化后的蛋白表觀分子質量在90 kD左右，與上清液分析的結果一致，Western blotting進一步證實純化后的蛋白具有漆酶活性。

圖4 純化后的6HN 和C6H重組酶SDS-PAGE（A）和Western blotting（B）分析Fig.4 Purity of 6HN and C6H enzymes assessed by SDS-PAGE (A, 7.5%, 2 μg/lane) and Western blotting (B, anti-LAC, 4 μg/lane)

2.4 重組漆酶的性質研究

2.4.1 pH值和溫度對酶活力的影響

圖5 pH值對漆酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on laccase activity

由圖5可知，在極端酸性或堿性的條件下，3 種重組漆酶的活力均降低，在pH 5.5時酶殘留活力最大，是其最佳pH值。在不同的pH值條件下將漆酶放置緩沖液中24 h并檢測其活性，發現3 種重組酶在酸性如pH 2.2條件下3 種重組酶活性損失較大，殘留活力LAC3為6%，6HN幾乎完全失活，對酸性條件非常敏感，C6H忍耐力略高，殘留酶活力為21%；而在中堿性條件下如在pH 8.0時活性穩定，殘留活力LAC3為89%，C6H為63%，6HN具較強的堿性耐受力，為96%。以LAC3做參照，將融合C端和N端組氨酸標簽重組酶相對活力與LAC3的相對活力進行比較，研究標簽對重組酶酸堿穩定性的相對影響隨pH值的變化見圖6。圖6A表明總體來說不同的pH值條件下在N端添加標簽獲得的重組酶比LAC3的酸堿穩定性更高，而C端組氨酸標簽的影響則相反（圖6B）。同樣，末端氨基酸序列的改變對熱穩定性的相對影響（以LAC3做參照）隨溫度的變化見圖7，可知末端添加標簽對漆酶的熱穩定性影響不大。

表1 所有重組酶在30 ℃，pH 6.0磷酸鹽緩沖液條件下的酶促動力學參數Table1 Kinetic parameters measurement of all the engineered enzymes in phosphate buffer (pH 6.0) at 30 ℃

圖6 融合組氨酸標簽的重組酶與LAC3相對活力的差異隨時間和pH值的變化Fig.6 Relative activity difference between fusion laccase as a function of time and pH

圖7 融合組氨酸標簽的重組酶與LAC3相對活力的差異隨時間和溫度的變化Fig.7 Relative activity difference between fusion laccase and LAC3 as a function of time and temperature

2.4.2 酶動力學性質研究

在30 ℃、pH 6.0的磷酸鹽緩沖液條件下分別以ABTS和SGZ為底物對3 種重組酶的酶促動力學參數進行測定，結果見表1。以SGZ做底物，C端和N端組氨酸標簽的加入對Km影響不大，但是以ABTS做底物，C端氨基酸序列的改變對Km值影響較大，但是與底物的親和力得到了增強。在對kcat/Km催化效率的影響方面，以SGZ做底物，C端氨基酸序列的改變使其催化效率降低一半，但是對ABTS做底物影響不大，N端氨基酸序列的改變使其催化效率略有降低。

3 討 論

雖然活性中心某些氨基酸組成和排列順序與漆酶活性緊密相關，但是C末端和N末端的修飾加工所帶來的影響也不可忽視，C末端和N末端對漆酶的正確折疊的意義有待于進一步研究。Gu等[24]在毛頭鬼傘漆酶的N端融合了一個含有10 個氨基酸的標簽并表達在畢赤酵母中，獲得的兩個重組酶lac3和lac4，其表觀活性的得到了顯著的提高。本研究試圖在LAC3漆酶的C端和N端進行延長，分別引入一個含有6 個組氨酸的標簽，探討了蛋白質兩端氨基酸序列的變化對漆酶活性的影響。通過該實驗成功獲得了2 個仍具有活性的重組漆酶，Western blotting檢驗具有組氨酸標簽，可用于漆酶自組裝單層膜的后續研究。漆酶兩端融合組氨酸標簽異源表達后獲得的新酶，與未融合的LAC3相比，兩端氨基酸序列的改變使其比活力保持在50%左右?？紤]到其對蛋白表達的影響，在C端引入組氨酸標簽的重組酶的表達量不受影響，但是N末端引入組氨酸標簽的重組酶其表達量只有LAC3的一半。添加組氨酸標簽的融合蛋白對ABTS和SGZ兩種底物的催化效率略有下降，但是對底物的親和力得到增強。而在酸堿和熱穩定性耐受方面，同LAC3相比，末端氨基酸的改變使其在酸堿穩定性方面得到了增強，熱穩定性方面則變化不大。雖然在酶兩端引入的氨基酸序列長度比較適中，僅6 個組氨酸，但是對酶性質的影響比較大，尤其是對N端的改造，這可能是因為N端插入氨基酸的位置離著胞外分泌信號肽的距離較近從而造成了表達量上的減少。

在對含標簽的蛋白用Ni-NTA柱進行純化過程中，發現蛋白結合在柱子上的量較少僅有10%～15%，造成純化得率較低，即通過組氨酸與鎳離子穩定的螯合作用的蛋白量少，而通過Anti-his（C-term）-HRP 抗體對蛋白進行檢測時，所有的蛋白均有強烈信號，這可能是由于融合的組氨酸標簽并未完全暴露在酶分子的表面，從而失去了與鎳離子螯合的機會。Bleve等[25]發現杏鮑菇漆酶基因EYR4在酵母中表達時并沒有漆酶活性，而通過對C端的氨基酸序列進行2～18 個不等氨基酸的切除時可獲得對底物有不同親和力的突變體，說明了C端序列對酶活力、穩定性和動力學的重要影響。也許通過對C端和N端的氨基酸序列進行部分切除，再加入組氨酸標簽會有利于酶分子活性中心及融合蛋白的暴露，可作為下一步的研究展開探索。此外，結晶技術可能是比較直觀獲得漆酶結構的方式，但是需要的重組酶產量較大純度較高，可通過對C和N末端截平后重組漆酶的變化比較后再做進一步深入研究。

另外，漆酶是一種糖蛋白，其含糖量和種類隨來源的不同而不同，釀酒酵母表達后，漆酶的表觀分子質量達90 kD左右。通過NetNGlyc 1.0對LAC3漆酶的序列進行N-glycosylation糖基化位點預測，其序列中含有7 個位點，假設每一條糖鏈有連接40 個甘露糖的潛力（約7 kD），7 個位點的分子質量共計約49 kD，而漆酶的理論分子質量在53 kD，總和與表觀分子質量相近，說明漆酶含糖量非常高，發生了高度糖基化，而糖基化對漆酶結構和酶活性的影響還有待于進一步研究，可以考慮直接去糖基化或者更換一種表達系統。

總的來說，雖然擔子菌漆酶C端和N端在漆酶中的作用還不明確，但是通過對漆酶C端和N端截平或者延長的可塑性研究，以期對擔子菌漆酶結構和功能的關系有進一步了解，為漆酶的改性獲得具有更好性狀的新型酶制劑研究和開發提供一定的思路和借鑒。

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Heterologous Expression of Trametes sp. Laccase in Saccharomyces cerevisiae and Characterization of Recombinant Enzyme by Fusing a Six-His Tag at N and C Termini

LIU Ying-li1, LIU Jun-ming1, WANG Jing1, SUN Bao-guo1,*, THIERRY Tron2
(1. Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Aix Marseille Université, CNRS, iSm2 UMR 7313, Marseille 13397, France)

Although some amino acid components and sequence of the active center are strongly related with laccase activity, the impact of C- and N-te rminal modifications cannot be neglected. The effects of C- and N- terminal plasticity on the activity, structure and properties of Basidiomycetes laccase are still unclear so far. In this study, the laccase gene LAC3 was cloned from Trametes sp. C30 and two mutants were obtained by fusing an additional 6-histidine tag at both C and N termini. All these stains were successfully expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The recombinant enzymes obtained were compared and the results showed that the modification of terminal amino acid sequence of the enzyme considerably affected its characteristics. Compared with LAC3, the production of C-terminal histidine-tagged recombinant enzyme was not affected, but the production of N-terminal histidine-tagged recombinant enzyme was only half of the amount of LAC3. The affinity to the substrate ABTS and SGZ was enhanced by both histidine-tagged fusion proteins. Compared with LAC3, the pH stability was enhanced and the activity was maintained better under alkaline or neutral conditions with the modification on the N-terminal. Studies of the pla sticity of the C and N termini have great significance to obtain new laccases.

laccase; heterologous expression; his-tag; C terminus; N terminus

TS201.2

A

1002-6630（2014）21-0143-06

10.7506/spkx1002-6630-201421028

2014-06-15

國家自然科學基金面上項目（31271976）；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養計劃項目（CIT&TCD20130309；IDHT20130506）；北京工商大學青年啟動基金項目（QNJJ2012-24）

劉英麗（1981—），女，講師，博士，主要從事食品品質改良研究。E-mail：liuyingli@th.btbu.edu.cn

*通信作者：孫寶國（1961—），男，教授，博士，主要從事食品質量與安全研究。E-mail：sunbg@btbu.edu.cn