響應面法優化雙酶水解技術生產嬰幼兒配方米粉工藝

劉梅森，林漢卿，張向陽，高麗霄，何小勇，張織芬，臧成國

（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東 深圳 518109）

響應面法優化雙酶水解技術生產嬰幼兒配方米粉工藝

劉梅森，林漢卿，張向陽，高麗霄，何小勇，張織芬，臧成國

（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東 深圳 518109）

為優化雙酶水解技術生產嬰幼兒米粉工藝，以α-淀粉酶添加量、β-淀粉酶添加量、調漿水溫度為主要影響因素，結合實際生產中的其他水解條件，在單因素試驗基礎上，運用Box-Behnken試驗設計原理，探討α-淀粉酶添加量、β-淀粉酶添加量、調漿水溫度的最佳組合。結果表明：α-淀粉酶添加量0.04?（相當于0.15 U/g）、β-淀粉酶添加量0.26%（相當于1 820 U/g）、調漿水溫度70.2 ℃時生產米粉的淀粉消化指數高達39.26%，與市售品牌米粉相比，淀粉消化指數提高10%以上。

嬰幼兒配方米粉；α-淀粉酶；β-淀粉酶；調漿水溫度；消化指數；響應面法

嬰幼兒營養米粉作為我國傳統的母乳替代品或嬰幼兒的補充、輔助食品而備受關注。由于攝取輔食嬰幼兒的胃、腸內淀粉水解酶較少，對淀粉類食品的消化能力差，傳統的米粉制品常使嬰幼兒產生脹氣、腹瀉等消化問題[1-3]。為了改善米粉的消化性能，有的米粉廠家開始研究并采用α-淀粉酶水解工藝[4-6]，α-淀粉酶作用淀粉分子中的α-1,4-葡萄糖苷鍵，水解從分子內部進行，水解中間位置的α-1,4-葡萄糖苷鍵，先后次序沒有一定規律，短時間內將淀粉大分子水解成較小分子質量的糊精[7]；有的米粉廠家采用先α-淀粉酶水解，再添加葡萄糖淀粉酶進行糖化的工藝，合理控制酶解程度。以上酶解工藝都是將淀粉大分子水解成短鏈小分子，一定程度上提高了米粉的消化性能，使其更易吸收。在生產中，淀粉回生也會降低米粉的消化性。眾所周知，淀粉加熱糊化后隨著溫度的降低，淀粉分子鏈趨于平行排列，相互靠攏，經氫鍵重新締合成結晶性結構，不能被淀粉酶水解，這就是淀粉的回生過程，回生一定程度上也會影響淀粉的消化性。有關抑制回生的研究表明大米淀粉外側短鏈聚合度一般為15～18，鏈長10 個單元以上易形成雙螺旋結構，加速回生[8-11]，用β-淀粉酶切斷大米支鏈淀粉外側支鏈可以有效抑制回生[12-15]。所以，本研究采用α-淀粉酶和β-淀粉酶生物酶解技術，控制酶解葡萄糖值在10%左右[16]生產嬰幼兒營養米粉，首先通過α-淀粉酶將淀粉長鏈大分子降解成短鏈小分子，提高了米粉的消化性能，減輕嬰幼兒腸胃消化負荷；通過β-淀粉酶修飾大米支鏈淀粉外側支鏈抑制淀粉回生，消除回生帶來的消化性的降低。雙酶工藝生產嬰幼兒配方米粉中有關酶解程度控制研究另見后續報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米 北京三安科技集團；蔗糖 廣西農墾糖業集團昌菱制糖有限公司；低聚果糖、低聚半乳糖 江門量子高科生物股份有限公司；奶粉 恒天然集團；花生油益海嘉里糧油有限公司；磷脂 杜邦Solae公司；濃縮乳清蛋白 美國Hilmar公司；大豆膳食纖維 山東谷神生物科技集團；二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、花生四烯酸（arachidonic acid，AA）廣東潤科生物工程有限公司；中溫α-淀粉酶（800 FΑU/g）諾維信（中國）生物技術有限公司；β-淀粉酶（70萬 U/mL） 山東隆大生物工程有限公司；胰酶美國Sigma公司；實驗所用水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

MG0505滾筒干燥機 江蘇東臺市億民食品機械廠；DF-15粉碎機 浙江大德制藥有限公司；80L調漿罐浙江蒼南縣立甌石化設備有限公司；752-P紫外分光光度計 上海現科儀器有限公司；HHS-6S水浴鍋 江蘇金壇市中大儀器廠；BL-2000S電子天平 美國西特公司；TG16-WS離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 嬰幼兒谷基配方米粉生產工藝

1.3.1.1 工藝流程

大米→粉碎→調漿→酶處理→添加輔料→細化→滾筒干燥→成型→檢驗→包裝

1.3.1.2 操作要點

粉碎：使用粉碎機將大米粉碎，過篩得到小于80 目（0.180 mm）的大米粉。

調漿：將大米粉使用一定溫度調漿水調制成質量分數為35%的淀粉乳。

酶處理：量取一定量的α-淀粉酶（pH 5.8，55～65 ℃，3 700 U/mL）和β-淀粉酶（pH 5.8，55～65 ℃，70萬 U/mL），用少量水稀釋后，添加到淀粉乳中保溫酶解40 min。

添加輔料：將奶粉、大豆分離蛋白、磷脂（先加水乳化）、蔗糖（先在化糖鍋中溶化）和大豆膳食纖維等依次加入調漿罐中，混合均勻。

細化：混合均勻后的混合料通過膠體磨細化。

滾筒干燥：滾筒干燥機蒸汽壓強調至0.5 MPa，轉速3 r/min。

1.3.2 酶活性測定方法

酶活性定義：在實驗溫度和pH值條件下，1 g（或1 mL）酶在1 h內完全水解1 g淀粉為一個酶活力單位（單位為U/g或U/mL）。

酶活性測定[17]：分別于具塞試管中加入質量分數2%可溶性淀粉10.0 mL、pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液5.0 mL，于40～65 ℃水浴中預熱5 min，然后加入質量分數1%的酶液0.5 mL，混勻并計時。按一定時間間隔取出酶解液，在白瓷板中以I2-KI液試之，待顏色變為橙黃色時，記錄反應時間。

式中：t為反應時間/min。

1.3.3 米淀粉體外消化性能

對米淀粉經酶解、滾筒干燥后得到的成品米粉進行體外消化性能的測定。根據Englyst等[18]對淀粉按其消化特性進行的劃分，用淀粉消化指數（starch digestion index，SDI）表征淀粉體外消化速率。采用豬胰酶水解米粉淀粉的方法，根據酶解速率計算產品的SDI值[19-22]。

取5 g樣品分別于250 mL燒杯中，加入蒸餾水50 mL、pH 7.2磷酸緩沖液10 mL，置于37℃水浴 中保溫5 min，然后加入質量分數1%豬胰酶0.4 mL。反應過程中，不斷取出約1 g漿料于預先添加了10 mL水的試管中，立即放入沸水浴中4 min使酶失活（預實驗4 min已完全失活），冷卻，于6 000 r/min轉速離心10 min，取上清液于50 mL容量瓶中定容。吸取2 mL已定容樣液，置于25 mL比色管中，再加入3,5-二硝基水楊酸溶液3 mL，沸水顯色5 min，然后以流水迅速冷卻，用水定容至25 mL，搖勻。以試劑空白調零，在540 nm波長處比色，參照預先制作的葡萄糖標準曲線求出還原糖含量，同法平行操作2 份，得出平均還原糖含量。

大米淀粉的消化性能通過快速消化淀粉（rapidly digested starch，RDS）、慢速消化淀粉和抗性消化淀粉質量分數表征。SDI是淀粉體外消化速率的常用指標。

式中：D為20 min內淀粉產生的葡萄糖質量/g；F為理論上淀粉水解成葡萄糖的質量/g；TS為總淀粉（total starch，TS）質量分數/%；RDS為快速消化淀粉質量分數/%。

1.3.4 Box-Behnken試驗設計

根據單因素試驗結果，采用響應面設計，運用Box-Behnken試驗設計原理，以淀粉消化指數為響應值，選定α-淀粉酶添加量、β-淀粉酶添加量和調漿水溫度，設計三因素三水平響應面分析試驗，其中淀粉酶添加量以占淀粉干基質量分數計，試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素和水平編碼值Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in response surface analysis

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

圖1 1 α-淀粉酶添加量對淀粉消化指數影響Fig.1 Effect of α-amylase concentration on starch digestion index

2.1.1 α-淀粉酶添加量對淀粉消化指數的影響由圖1可知，淀粉消化指數隨著α-淀粉酶添加量的增加不斷增大，當添加量超過0.04?時，淀粉消化指數增勢趨緩，考慮到添加過多的酶對米粉的淀粉消化指數提高不大，反而增加生產成本，所以選擇α-淀粉酶添加量為0.04 ?左右較為合適。

2.1.2 β-淀粉酶添加量對淀粉消化指數的影響

圖2 2 β-淀粉酶添加量對淀粉消化指數影響Fig.2 Effect of β-amylase concentration on starch digestion index

由圖2可知，淀粉消化指數隨著β-淀粉酶添加量的增加不斷的增大，當添加量超過0.25%時，淀粉消化指數增勢趨緩，考慮到添加過多的酶對米粉的淀粉消化指數提高不大，還會引起生產成本的提高，所以選擇β-淀粉酶添加量為0.25%左右較為合適。

2.1.3 調漿水溫度對淀粉消化指數的影響

圖3 調漿水溫度對淀粉消化指數影響Fig.3 Effect of water temperature on starch digestion index

由圖3可知，在酶添加量不變的情況下，淀粉消化指數隨著調漿水溫度的升高先增加后減少，當調漿水溫度為70 ℃時，淀粉消化指數最大，所以選擇調漿水溫度為70 ℃左右較為合適。

2.2 響應面法優化米粉酶解生產工藝

2.2.1 模型建立及顯著性分析

根據表1方案進行響應面試驗，在17 個試驗中，1～12是析因試驗，13～17是中心試驗，用來估算試驗誤差。響應面分析試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 響應面分析試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

由表3可以看出，Α、Α2、C2為顯著性影響因素。在各影響因素中，α-淀粉酶添加量對淀粉消化指數影響最大，其次是調漿水溫度和β-淀粉酶添加量。經回歸擬合后，試驗因素對響應值的影響可用回歸方程表示。

Y=39.37+1.39Α+0.18B+0.33C+0.12ΑB-0.21ΑC+ 0.070BC-1.94Α2-0.40B2-4.00C2

由表3可見，整體模型的顯著水平P＜0.000 1，表明試驗所選的二次多項模型具有高度顯著性，能夠很好的描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定米粉最佳酶解工藝參數。同時，失擬項P=0.693 7＞0.05，表明差異不顯著，說明殘差均由隨機誤差引起；該模型R2=99.51%，R2Adj=98.88%，說明該模型與試驗模擬性良好。

表3 響應面試驗方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.2 響應面優化與分析

根據模型方程繪制淀粉消化指數響應面圖，結果如圖4～6所示。從圖中可以直觀地看出各因素對淀粉消化指數的影響。

圖4 4 α-淀粉酶添加量和β-淀粉酶添加量對淀粉消化指數影響的響應面圖Fig.4 Response surface plot for the effect of cross-interaction between α-amylase concentration and β-amylase concentration on starch digestion index

由圖4、5可以看出，當β-淀粉酶添加量和調漿水溫度不變時，淀粉消化指數隨α-淀粉酶添加量的增加而增加；當α-淀粉酶添加量和調漿水溫度不變時，淀粉消化指數隨β-淀粉酶添加量的增加而增加。α-淀粉酶添加量對淀粉消化指數影響較β-淀粉酶添加量顯著，表現為曲線較陡。由圖5、6可以看出，當α-淀粉酶添加量和調漿水溫度不變時，淀粉消化指數隨β-淀粉酶添加量的增加而增大；在β-淀粉酶添加量不變時，淀粉消化指數先隨調漿水溫度的升高而增加，達到一定溫度后反而逐漸減少。

圖5 5 α-淀粉酶添加量和調漿水溫度對淀粉消化指數影響的響應面圖Fig.5 Response surface plot for the effect of cross-interaction between α-amylase concentration and water temperature on starch digestion index

圖6 6 β-淀粉酶添加量和調漿水溫度對淀粉消化指數影響的響應面圖Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction between β-amylase concentration and water temperature on starch digestion index

通過對模型方程求導計算，得到最高的淀粉消化指數酶解工藝參數為α-淀粉酶添加量0.04?、β-淀粉酶添加量0.26%、調漿水溫度70.17 ℃，由模型方程預測得到此時的淀粉消化指數是39.65%。

根據響應面優化結果，以α-淀粉酶添加量0.04?、β-淀粉酶添加量0.26%、70.2 ℃調漿水生產米片，通過3 次驗證實驗，所得米片的淀粉消化指數依次是39.01%、39.41%和39.36%，平均值是39.26%，與模型方程預測值基本一致。

2.3 不同品牌米粉淀粉消化性能比較

按照2.2.2節中米粉優化工藝再添加奶粉、蔗糖、濃縮乳清蛋白、DHA等輔料生產米粉，將酶解工藝生產米粉與本公司非酶解工藝生產米粉、市售3種暢銷米粉進行體外消化實驗測定其淀粉消化性能[16]，測定結果如表4所示。研究中實驗數據用Excel軟件進行輸入，并用SPSS軟件包進行單因素方差分析。

表4 不同品牌米粉淀粉消化性能比較Table 4 Comparison of starch digestion among different brands of infant rice powder

從表4可以看出，本研究使用的雙酶工藝生產的米粉淀粉消化指數最高，達到39.41%，比市售非酶解工藝生產米粉、酶解工藝生產米粉淀粉消化指數都有不同程度的提高。與本公司非酶解工藝米粉相比，淀粉消化指數提高了85%，與市售品牌3米粉相比，淀粉消化指數提高108%。與其他品牌廠家酶解工藝生產的米粉，雙酶工藝生產的米粉在淀粉消化指數上仍有其優勢，淀粉消化指數提高都超過10%。目前市售酶解工藝米粉多是運用α-淀粉酶或α-淀粉酶結合葡萄糖淀粉酶生產，而本研究生產的米粉不僅從α-淀粉酶將淀粉長鏈分子降解為短鏈小分子著手，還運用β-淀粉酶剪切淀粉分子外側支鏈以抑制回生，從而有效抑制回生帶來的消化性能的降低。姚遠等[23]通過米飯粒硬度和脈沖核磁共振測試表明，采用β-淀粉酶對米淀粉進行適度降解可通過縮短支鏈淀粉分子的外側支鏈長度而顯著延緩淀粉的回生速率，改善消化性能。

3 結 論

利用Box-Behnken試驗設計和響應面分析，探討提高淀粉消化指數的最佳酶解工藝參數，所建立的試驗模型能夠反映響應值的變化，對試驗的擬合較好。優化結果顯示，在α-淀粉酶添加量0.04?、β-淀粉酶添加量0.26%、調漿水溫度70.2 ℃條件下生產的米粉淀粉消化指數高達39.26%。以此條件為基礎生產的米粉與本公司非酶解工藝生產米粉、市售3 種品牌米粉比較，其淀粉消化指數提高10%以上。

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Optimization of Double Enzymatic Hydrolysis of Rice for Production of Infant Formula Rice Powder Using Response Surface Methodology

LIU Mei-sen, LIN Han-qing, ZHANG Xiang-yang, GAO Li-xiao, HE Xiao-yong, ZHANG Zhi-fen, ZANG Cheng-guo
(Shenzhen Weicky Biotechnology Co. Ltd., Shenzhen 518109, China)

The enzymatic hydrolysis of rice slurry with α-amylase and β-amylase for use in infant formula rice powder was optimized using a Box-Behnken design with response surface methodology. The optimal hydrolysis conditions were established as follows: 0.04? (equivalent to 0.15 U/g) α-amylase, 0.26% (equivalent to 1 820 U/g) β-amylase, and hydrolysis at 70.2 ℃, yielding a starch digestion index as high as 39.26%, which represented an over 10% increase over that reported for commercial infant rice powder.

infant formula rice powder; α-amylase; β-amylase; mashing temperature; starch digestion index; response surface methodology

TS216

A

1002-6630（2014）22-0063-05

10.7506/spkx1002-6630-201422012

2014-03-12

廣東省產業技術研究與開發資金項目（2012B020402002）

劉梅森（1968—），男，教授級高級工程師，博士，研究方向為食品科學。E-mail：meisen18@sina.com