湘葛一號莖葉中5 種異黃酮成分的高效液相色譜法定量分析

葉惠煊，李 芝，李小軍，黃瑋超，謝 霞，劉向前*

（湖南中醫藥大學藥學院，湖南省中藥現代化研究重點實驗室，湖南 長沙 410208）

湘葛一號莖葉中5 種異黃酮成分的高效液相色譜法定量分析

葉惠煊，李 芝，李小軍，黃瑋超，謝 霞，劉向前*

（湖南中醫藥大學藥學院，湖南省中藥現代化研究重點實驗室，湖南 長沙 410208）

建立高效液相色譜法同時測定湘葛一號地上部分中5 種異黃酮成分含量的方法。采用AT LICHROM C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長250 nm，柱溫30 ℃。葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素分別在5.00～50.00（r=0.999 4）、1.00～10.00（r=0.999 2）、3.64～36.40（r=0.999 9）、0.50～5.00 μg/mL（r=0.999 8）和0.10～1.00 μg/mL（r=0.999 4）范圍內線性良好，檢測限分別為0.94、0.24、0.43、0.08 ng/L和0.05 ng/L，定量限分別為2.85、0.73、1.29、0.25 ng/L和0.15 ng/L。精密度、穩定性和重復性良好，平均回收率分別為100.11%（相對標準偏差（RSD）為1.39%）、99.54%（RSD為1.47%）、98.06%（RSD為0.32%）、101.52%（RSD為1.89%）和101.05%（RSD為0.32%）。該方法快速、準確，操作簡單，可用于湘葛一號地上部分5 種異黃酮成分含量的同時測定。

湘葛一號；高效液相色譜法；葛根素；大豆苷；染料木苷；大豆苷元；染料木素

葛根作為一種重要的藥食同源植物，富含葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素等異黃酮類化合物[1]，除具有解肌退熱、生津止渴、透疹、通經活絡等藥用功效外[2]，還廣泛用作食品原料或添加劑[3]。湘葛一號（Hu’nanPueraria thomsonii Benth）[4]是我國第一個通過雜交選育的葛根新品種，產量高，性狀好，目前已在湖南多地大面積推廣栽培。

目前，國內外學者對葛根的化學成分[5-9]及其藥理作用[10-14]已有比較多的報道，但對其廢棄的地上部分鮮有報道。大量的葛根地上部分被廢棄，破壞環境且造成極大的資源浪費，如何對葛根廢棄的地上部位的合理利用是我們需要思考的問題。現今，已有對三七[15-16]、酸棗[17]、川芎[18]、當歸[19]等藥、食用資源的地上廢棄部分的化學成分進行了研究，并取得了一定的進展。為了綜合開發利用葛根資源，系統研究湘葛一號的使用價值，在本課題組研究基礎上[20]，本實驗進一步采用高效液相色譜法同時測定了不同采收期湘葛一號地上部分莖和葉中葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素5 種異黃酮類化合物，為充分利用湘葛一號地上部分提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湘葛一號地上部分的莖和葉，于2011年5月至12月采至湖南省常德市湘葛一號種植基地，所有樣品粉碎過60 目篩后備用。

葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素（質量分數≥98%，批號分別為110752-200511、111738-200501、111709-200501、111505-200402、111704-200501） 中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；AUW220D分析天平 日本島津公司；FW177中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；予華HH-S型水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

色譜柱：AT LICHROM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（V/V），梯度洗脫；流速1 mL/min；檢測波長250 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。梯度洗脫程序見表1。在上述色譜條件下，各待測成分分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）、湘葛一號莖（B）、湘葛一號葉（C）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A), and isoflavones in stems (B) and leaves (C) of Pueraria thomsonii Benth

1.3.2 混合對照品溶液的制備

分別取葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素和染料木苷對照品適量，精密稱定，置于同一25 mL量瓶中，加入適量甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，制成質量濃度分別為0.050 0、0.010 0、0.036 4、0.005 0、0.001 0 mg/mL的混合標準品溶液，備用。

1.3.3 供試品溶液的制備

取湘葛一號莖粉末（201112 S）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積分數50%乙醇50 mL，密塞，稱定質量，80 ℃水浴加熱回流50 min，放冷，再稱定質量，用體積分數50%乙醇補足減少的質量，搖勻，濾過，取續濾液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

精密量取混合對照品溶液各1、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，按1.3.1節色譜條件分別進樣10 μL。以峰面積為縱坐標，混合對照品質量濃度為橫坐標進行線性回歸。按信噪比的3 倍和10 倍考察檢測限和定量限，結果見表2。

表2 5 種異黃酮成分的線性關系Table 2 Linear equations for five isoflavones

2.2 精密度實驗

取同一混合對照品溶液，連續進樣6 次，測定峰面積。計算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.11%、2.27%、2.63%、2.07%和0.67%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩定性實驗

穩定性實驗包括日內穩定性與日間穩定性。取同一供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h及2、3、4、5、6 d后進樣，計算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的峰面積RSD分別為0.87%、1.92%、0.72%、1.54%和2.56%，表明供試品溶液在24 h內穩定。計算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的峰面積RSD分別為0.55%、0.74%、0.87%、1.28%和2.65%，表明供試品溶液在6 d內穩定。

2.4 重復性實驗

取201112 S粉末6 份，按1.3.3節方法制備供試品溶液，分析計算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素峰面積的RSD分別為1.45%、1.63%、1.88%、0.64%和1.26%，表明本法重復性良好。

2.5 加樣回收實驗

取201112 S粉末6 份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入適量的對照品混合溶液，按照1.3.3節方法制備供試品溶液，依次測定，分別計算各對照品的平均回收率。結果表明，葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的平均回收率分別為100.11%、99.54%、98.06%、101.52%和101.05%，RSD分別為1.39%、1.47%、0.32%、1.89%和0.32%。

2.6 樣品測定

分別精密吸取一年內不同采收期湘葛一號不同部位供試品溶液10 μL，進樣測定。分別采用外標法計算葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量。具體數據見表3。

表3 湘葛一號不同部位含量測定結果比較（n=3）Table 3 Comparison of isoflavone contents in stems and leaves of Pueraria thomsonii Benth (n=3) mg/g

3 討論與結論

在制備供試品溶液時，筆者考察了不同提取方法（超聲和回流），不同提取溶劑（甲醇、體積分數30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇），不同提取時間（30、40、50 min和60 min），不同提取溫度（40、50、60、70、80 ℃和90 ℃）等方法。結果表明，本實驗最佳提取條件為提取溶劑體積分數50%乙醇、提取溫度80 ℃、回流時間50 min。

對一年生不同采收期的湘葛一號莖的主要異黃酮成分含量的比較分析發現：葛根素含量12月＞11月＞9月＞5月＞10月＞7月＞8月＞6月；大豆苷含量12月＞5月＞11月＞9月＞8月＞10月＞7月＞6月；染料木苷含量12月＞9月＞11月＞8月＞10月＞5～7月；大豆苷元含量12月＞11月＞8月＞6月＞7月＞10月＞9月＞5月；染料木素含11月＞12月＞8月＞10月＞5月＞7月＞9月＞6月。總體看出，12月份的莖總異黃酮含量最高，6、7月份的含量相對較低。而5～12月份的湘葛一號葉中5 種異黃酮成分含量雖然均較低，但也呈現一定的動態變化，具體原因有待進一步研究。

由于湘葛一號的植物學特性[21]，其蘆頭（塊根近莖部位約三分之一處）纖維較高，粉性少，在采收時都要將其削除，造成大量的浪費。故本實驗還進一步對9月份湘葛一號蘆頭進行檢測（表3），實驗發現蘆頭中除染料木素未檢測到外，其余4 種異黃酮成分含量均較高。值得注意的是，其葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量顯著高于同時期的莖和葉部，極具綜合利用價值，故今后課題組將對不同產地、不同采收期湘葛一號蘆頭作為研究重點。

本實驗方法建立的同時測定湘葛一號地上部分異黃酮成分含量檢測方法快速、簡便、靈敏度高，可用于湘葛一號廢棄部位的含量控制。湘葛一號的莖葉中，尤其是莖中含有相對較高的異黃酮類成分，完全能夠變廢為寶，作為提取分離這些有效成分的新資源。

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Simultaneous Determination of Five Isoflavones in Stems and Leaves of Pueraria thomsonii Benth ‘Xiangge No.1’ by HPLC

YE Hui-xuan, LI Zhi, LI Xiao-jun, HUANG Wei-chao, XIE Xia, LIU Xiang-qian*
(Modernization Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Drug, College of Pharmacy, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

An HPLC method was presented for the simultaneous determination of five isoflavones simultaneously in the aerial (leaves and stems) parts of Pueraria thomsonii Benth ‘Xiangege No.1’. The chromatography was performed on an AT LICHROM C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) with a mobile phase of methanol-water by gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min, and the detection wavelength was set at 250 nm and the column temperature at 30 ℃. The calibration curves for puerarin, daidzin, genistin, daidzein and genistein were linear in the range of 5.00-50.00 (r = 0.999 4), 1.00-10.00 (r = 0.999 2), 3.64-36.40 (r = 0.999 9), 0.50-5.00 (r = 0.999 8) and 0.10-1.00 μg/mL (r = 0.999 4), respectively. The LODs were 0.94, 0.24, 0.43, 0.08 and 0.05 ng/L, and the LOQs were 2.85, 0.73, 1.29, 0.25 and 0.15 ng/L. The method had good precision, stability and reproducibility, and the mean recoveries for puerarin, daidzin, genistin, daidzein and genistein were 100.11% (RSD = 1.39%), 99.54% (RSD = 1.47%), 98.06% (RSD = 0.32%), 101.52% (RSD = 1.89%) and 101.05% (RSD = 0.32%), respectively. In conclusion, this study has proposed a rapid, accurate and simple method which allows the simultaneous determination of five isoflavones in the aerial parts of Pueraria thomsonii Benth.

Hu’nan Pueraria thomsonii Benth; high performance liquid chromatography; puerarin; daidzin; genistin; daidzein; genistein

R284.1

A

1002-6630（2014）14-0141-04

10.7506/spkx1002-6630-201414027

2014-01-13

湖南省自然科學基金重點項目（11JJ2042）；長沙市科技局科技計劃重點項目（K1207010-21）；湖南中醫藥大學藥物分析學“十二五”校級重點學科建設項目（2012-2）

葉惠煊（1988—），男，碩士研究生，研究方向為中藥質量控制及其活性成分。E-mail：yehuixuan@qq.com

*通信作者：劉向前（1967—），男，教授，博士，研究方向為中藥質量控制及其活性成分。E-mail：lxq0001cn@163.com