海水養(yǎng)殖環(huán)境中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解菌的分離鑒定及降解特性研究*

孫愛麗 劉菁華 史西志 張蓉蓉 肖婷婷 李德祥 陳 炯 唐道軍

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211)

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一類高效廣譜農(nóng)藥,經(jīng)常用于漁業(yè)生產(chǎn)上殺滅寄生蟲和敵害生物,但由于沒有指導(dǎo)性用量及養(yǎng)殖用戶缺乏科學(xué)理論知識(shí),在清塘?xí)r使用違禁、不規(guī)范、盲目大量使用藥物的現(xiàn)象普遍存在,導(dǎo)致近海海域水環(huán)境和沉積物中農(nóng)藥殘留污染(王帥等,2013)。目前,越來越多的研究表明,該類農(nóng)藥對(duì)人類等非靶標(biāo)生物產(chǎn)生相當(dāng)大的威脅,具有內(nèi)分泌干擾、免疫和神經(jīng)毒性等多種潛在毒性,對(duì)魚、貝和甲殼類等水生生物毒性較大,尤其是存在于沉積物中的農(nóng)藥降解速度較慢。且該類農(nóng)藥屬親脂性農(nóng)藥,易被水生生物富集,對(duì)水體生態(tài)系統(tǒng)、水產(chǎn)品質(zhì)量和人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響(Almakkawyet al,1999;于蓉蓉等,2009;魏華等,2010)。因此,為實(shí)現(xiàn)綠色健康養(yǎng)殖和保障人類健康,以生物修復(fù)為理論基礎(chǔ)的農(nóng)藥殘留降解技術(shù),由于具有降解速度快、降解過程為自然過程的強(qiáng)化,不會(huì)導(dǎo)致二次污染和污染物的轉(zhuǎn)移,可使環(huán)境中的污染物減少到最小程度等優(yōu)點(diǎn)(Liet al,2007;Honget al,2010),已引起了越來越廣泛的關(guān)注,成為當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

目前,國內(nèi)外已有不少學(xué)者對(duì)環(huán)境中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的微生物降解進(jìn)行了研究報(bào)道,Rangaswamy等(1992)研究發(fā)現(xiàn)土壤中的某些細(xì)菌對(duì)氯氰菊酯和氰戊菊酯農(nóng)藥具有降解作用;虞云龍等(1999)從農(nóng)藥廠的廢水中分離得到一株光譜農(nóng)藥降解菌,對(duì)氰戊菊酯、溴氰菊酯、甲基對(duì)硫磷和對(duì)硫磷等具有降解功效;Grant等(2002)從使用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的土壤中分離得到擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解菌,并對(duì)其生長(zhǎng)限制因子進(jìn)行了研究;Chen等(2012)研究表明,蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereusZH-3和金色鏈霉菌Steptomyces aureusHP-S-01組成的復(fù)合菌群可充分利用氯氰菊酯,降解較徹底。對(duì)于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解產(chǎn)物的研究也有少量報(bào)道,Stratton等(1982)報(bào)道分離的降解菌降解產(chǎn)物通常比農(nóng)藥本體的毒性更小,但是 CYP恰恰相反,其本體相對(duì)無毒,降解產(chǎn)物中有2—5種毒性更強(qiáng);Lin等(2011)報(bào)道分離的菌株——鏈霉菌Streptomycessp.HY-S-01可通過水解酶的作用降解CYP,產(chǎn)生間苯氧基苯甲酸和二氯菊酸。總體來看,國內(nèi)外對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解菌的研究主要集中在菌株的篩選、分離、鑒定及其降解特性方面,對(duì)近海水環(huán)境及沉積物中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解菌的篩選、降解機(jī)制等尚未有系統(tǒng)研究。本論文通過篩選、分離獲得一株能高效降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的海洋降解菌HS-10,采用生理生化和16S rDNA的序列比對(duì)方法對(duì)其進(jìn)行初步鑒定,并分別研究了 pH、溫度和不同農(nóng)藥濃度對(duì)菌株HS-10降解特性的影響,進(jìn)一步通過發(fā)光細(xì)菌和核磁共振(NMR)對(duì)菌株降解產(chǎn)物的毒性變化和成分進(jìn)行了研究。本研究可為建立有效地去除海水養(yǎng)殖環(huán)境中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的微生物修復(fù)技術(shù),保護(hù)近海環(huán)境、治理養(yǎng)殖環(huán)境農(nóng)藥殘留污染和保障食品安全提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

聯(lián)苯菊酯(BIF)、氟氯氰菊酯(CYF)、氯氰菊酯(CYP)、氰戊菊酯(FEN)和溴氰菊酯(DEL)購自 Dr.Ehrenstorfer GmbH(Augsburg,德國)。

營養(yǎng)培養(yǎng)基:蛋白胨5.0g,磷酸高鐵0.01g,酵母膏1.0g,過濾海水1000mL,pH 7.6—7.8。

富集培養(yǎng)液:在營養(yǎng)培養(yǎng)基中加入 CYP、DEL乳液,使CYP、DEL終濃度分別為100mg/L。

儀器:GC-2010型氣相色譜儀(日本島津),Microtox Model 500毒性檢測(cè)儀(美國 SDI),核磁共振儀(Bruker NA 400,德國)。

1.2 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解菌的分離、篩選

將500mL海水過濾、富集后的樣品加入到100mL含有CYP、DEL各100mg/L的滅菌富集培養(yǎng)液中,于28°C、180r/min搖床培養(yǎng) 7d后,按 10%接種量轉(zhuǎn)移到含2種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥各100mg/L的富集培養(yǎng)液中,繼續(xù)培養(yǎng) 7d,重復(fù)上述步驟連續(xù)富集培養(yǎng) 3次,取0.1mL培養(yǎng)液進(jìn)行平板劃線分離、純化,直到篩選得到單個(gè)菌落,將其接種到試管斜面培養(yǎng)基上,于4°C低溫保存。

將分離得到的各個(gè)菌株制成菌懸液,以相同接種量(OD600= 0.2)加入到100mL富集培養(yǎng)液中,做3個(gè)平行試驗(yàn),28°C搖床中180r/min培養(yǎng)7d后,測(cè)定擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留量,以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照,采用式(1)計(jì)算農(nóng)藥的降解率。

式中,W0為空白對(duì)照中農(nóng)藥的含量;Wt為接菌的培養(yǎng)液中農(nóng)藥的殘留量。

1.3 菌種鑒定

利用常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色觀察,根據(jù)常用細(xì)菌鑒定手冊(cè)對(duì)菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)(Bridgeet al,1993),通過掃描電子顯微鏡觀察菌株 HS-10的細(xì)胞形態(tài)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮菌液,3000r/min離心收集菌體,提取基因組 DNA作為擴(kuò)增模版;采用細(xì)菌通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1541R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′)(孫蘇燕等,2009)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性2min;循環(huán)擴(kuò)增 35 次:94°C 30s,60°C 30s,72°C 1min;72°C延伸 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后,雙向測(cè)序,通過BLAST進(jìn)行同源性比較。

1.4 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測(cè)

1.4.1 樣品前處理 準(zhǔn)確量取菌液 1.0mL,加入0.4g氯化鈉、4.0mL正己烷/丙酮(1 :1,V/V)混合液,渦旋1min,3000r/min離心10min,取上清液;然后加入2.0mL正己烷/丙酮(1 :1,V/V),重新提取1次;將獲得的上清液加入 0.4g無水硫酸鈉,渦旋混勻,3000r/min離心5min,取3.0mL上清液,40°C氮?dú)獯蹈珊?加入1.0mL異辛烷/丙酮(9 :1,V/V)溶解,0.22 μm濾膜過濾后,GC-ECD分析,實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.4.2 色譜條件 SPB-5石英彈性毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm);ECD 檢測(cè)器;色譜柱溫 150°C(5min),40°C /min;240°C(10min),5°C/min;260°C(3min);檢測(cè)器溫度 320°C,進(jìn)樣口溫度 280°C,進(jìn)樣量為1.0μL,柱流量1.0mL/min;分流比為1 :30;載氣為N2(99.999%),采用外標(biāo)法計(jì)量。

1.5 降解條件的優(yōu)化

培養(yǎng)溫度:培養(yǎng)溫度分別為 20°C、28°C 和 35°C,液體培養(yǎng)基(CYP和DEL濃度為100mg/L)初始pH為7.6,搖床轉(zhuǎn)速 180r/min,在此培養(yǎng)條件下,測(cè)定菌株HS-10在7d后的降解率。

初始 pH:液體培養(yǎng)基(CYP和 DEL的濃度為100mg/L)的初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0,恒定溫度28°C,搖床轉(zhuǎn)速180r/min,測(cè)定菌株HS-10在7d后的降解率。

不同初始濃度:液體培養(yǎng)基中CYP和DEL初始濃度分別為100、200、400、600、800mg/L,分別接入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液,在溫度28°C、pH 7.0、搖床轉(zhuǎn)速180r/min條件下培養(yǎng),測(cè)定菌株HS-10在7d后的降解率。

每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。

1.6 菌株降解產(chǎn)物分析

將菌株HS-10接種于含100mg/L CYP或DEL的液體培養(yǎng)基中,于28°C、180r/min搖床培養(yǎng)7d后,按“1.4.1 樣品前處理”步驟提取降解產(chǎn)物后,溶于1.0mL氘代丙酮(CD3COCD3)中,以四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo),經(jīng)NMR分析。

1.7 菌株降解產(chǎn)物毒性分析

將菌株HS-10接種于含100mg/L CYP或DEL的滅菌液體培養(yǎng)基中,于 28°C、180r/min搖床培養(yǎng) 7d后,取2.0mL菌液3000r/min,離心10min,取上清液通過Microtox Model 500 Toxicity Analyzer System進(jìn)行毒性分析,以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照,做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),采用式(2)計(jì)算發(fā)光抑制率。

式中,Io為初始發(fā)光強(qiáng)度;It為樣品發(fā)光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解菌株 HS-10的分離、篩選及特性分析

經(jīng)分離、篩選獲得1株具有高效CYP和DEL降解能力的菌株,命名為 HS-10。生物學(xué)特性為:革蘭氏染色陰性(圖1),為桿菌(圖2),精氨酸雙水解試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、鳥氨酸脫羧試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)陽性,V-P反應(yīng)、H2S反應(yīng)、明膠液化實(shí)驗(yàn)陰性,可以利用蔗糖。在固體培養(yǎng)基上,菌落圓形、凸起,邊緣完整,呈灰白色,半透明。

圖1 菌株HS-10的革蘭氏染色顯微鏡圖片F(xiàn)ig.1 Microscopic image of strain HS-10 after Gram-staining

圖2 菌株HS-10的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopic photography of strain HS-10

為進(jìn)一步鑒定HS-10,在生理生化分析的基礎(chǔ)上,以16S rDNA(鄧先余等,2009)通用引物27F和1541R進(jìn)行PCR擴(kuò)增(孫蘇燕等,2009),提交GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊(cè)得到序列號(hào)為JX087926。經(jīng)BLAST同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),該菌株的16S rDNA與假交替單胞菌相似度最高,進(jìn)一步結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征可初步鑒定該菌株為假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)。

2.2 菌株HS-10降解條件的優(yōu)化

2.2.1 溫度對(duì)菌株 HS-10生長(zhǎng)及降解效率的影響溫度作為微生物生長(zhǎng)及代謝的重要因子,在適宜的溫度范圍內(nèi),微生物通常表現(xiàn)出較快的生長(zhǎng)和代謝速率,因此,試驗(yàn)首先設(shè)定不同培養(yǎng)溫度,考察菌株HS-10的生長(zhǎng)速率和降解性能。由圖3可以看出,在20°C和28°C培養(yǎng)條件下,菌株HS-10在富集培養(yǎng)基中前4天生物量增長(zhǎng)較快,后達(dá)到穩(wěn)定期,繼續(xù)培養(yǎng),其生物量則出現(xiàn)降低趨勢(shì);進(jìn)一步通過圖4的降解曲線可以看出,菌株HS-10對(duì)CYP和DEL的降解主要集中在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(1—4d),這是因?yàn)樵摃r(shí)期菌株對(duì)碳源的需求量較大,因此對(duì)CYP和DEL的降解更快;而隨著培養(yǎng)基中的碳源和氮源逐漸減少及菌株代謝產(chǎn)物的積累,導(dǎo)致菌體的生長(zhǎng)受到抑制,對(duì) CYP和DEL的降解效率隨之減少。同時(shí),結(jié)果表明,當(dāng)培養(yǎng)溫度為 35°C時(shí),由于高溫影響菌株的生長(zhǎng),其生長(zhǎng)相對(duì)較緩慢,同時(shí),CYP和DEL的降解效率有所下降,表明高溫對(duì)菌株的降解效率有較大影響。其中,28°C培養(yǎng)時(shí)菌株 HS-10的生長(zhǎng)及降解效率明顯優(yōu)于其它溫度,對(duì) CYP和 DEL的降解率分別為 62.1%和88.5%。由此可知,菌株HS-10降解CYP和DEL的最佳溫度為28°C。

圖3 不同溫度下菌株HS-10的生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curves of strain HS-10 at different temperature

圖4 溫度對(duì)CYP和DEL降解率的影響Fig.4 The effect of temperature on CYP and DEL degradation rate a.20°C;b.28°C;c.35°C

2.2.2 培養(yǎng)液初始 pH對(duì)菌株 HS-10生長(zhǎng)及降解效率的影響 菌株HS-10在不同初始pH的液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)及降解效率見圖5、圖6。從圖中可以看出,菌株HS-10對(duì)pH的耐受性較為寬泛,在4.0—8.0范圍內(nèi)可良好生長(zhǎng),且對(duì)CYP和DEL的降解率均高于50%。與酸性培養(yǎng)條件相比,菌株HS-10在pH 7.0和pH 8.0時(shí)具有更大的生物量,對(duì)CYP和DEL具有更大的降解效率,尤其當(dāng)pH 7.0時(shí),對(duì)CYP和DEL的降解率分別為75.6%和90.9%。由此可知,菌株HS-10在堿性條件下能更好地生長(zhǎng),表現(xiàn)出更大的降解活性,其降解CYP和DEL的最佳pH為7.0。

圖5 初始pH對(duì)菌株HS-10生長(zhǎng)的影響Fig.5 The effect of initial pH on growth of strain HS-10

圖6 初始pH對(duì)CYP和DEL降解效率的影響Fig.6 The effect of initial pH on CYP and DEL degradation rate

2.2.3 不同初始濃度CYP和DEL的降解效率 將菌液以10%的接種量在無菌條件下轉(zhuǎn)入100mL初始濃度分別為 100、200、400、600、800mg/L的 CYP和DEL培養(yǎng)液中,在180r/min、28°C、pH 7.0條件下分別養(yǎng) 7d后,測(cè)定 CYP和 DEL的降解率。由圖7可知,CYP和DEL初始濃度的變化對(duì)菌株的降解性能有一定的影響,隨著初始濃度的增加,HS-10對(duì)CYP和DEL的降解率呈下降趨勢(shì),但當(dāng)CYP和DEL初始濃度低于 200mg/L時(shí),菌株 HS-10對(duì) CYP和DEL仍保持相對(duì)較高的降解率,分別為 47.5%和65.2%。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),初始濃度在100—400mg/L范圍內(nèi)時(shí),菌株HS-10對(duì)CYP和DEL的絕對(duì)降解量隨其初始濃度的增加而增大,但是隨著初始濃度的進(jìn)一步增加,HS-10對(duì)CYP和DEL的絕對(duì)降解量呈下降趨勢(shì),表明較高的初始濃度可能對(duì)菌株的生長(zhǎng)和降解性能產(chǎn)生抑制,當(dāng)初始濃度高于 400mg/L時(shí),CYP和DEL的降解率和降解量顯著降低。

圖7 菌株HS-10對(duì)不同初始濃度CYP和DEL的降解率和降解量Fig.7 Biodegradation rate and quantity of CYP and DEL at different initial concentrations by strain HS-10

2.3 菌株HS-10降解產(chǎn)物分析

將有毒有害污染物通過微生物降解轉(zhuǎn)化為無毒無害的物質(zhì),是污染物生物修復(fù)的核心。研究表明,擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的微生物降解途徑主要包括氧化、還原、水解等過程,代謝比較復(fù)雜,降解產(chǎn)物種類較多,性質(zhì)各異(Talluret al,2008),因此,為充分評(píng)價(jià)菌株HS-10降解產(chǎn)物的毒性,本研究采用發(fā)光細(xì)菌和NMR的方法對(duì)CYP和DEL降解產(chǎn)物的特性進(jìn)行了分析。

當(dāng)發(fā)光細(xì)菌接觸有毒有害物質(zhì)時(shí),可影響其正常的新陳代謝,從而使它的發(fā)光強(qiáng)度受到抑制,利用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度受抑制的程度與物質(zhì)的毒性大小呈正相關(guān)的特性,可實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物的毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明(表1),濃度為 100mg/L的CYP和 DEL溶液(發(fā)光抑制率分別為90.3%±6.1%),降解后產(chǎn)物對(duì)發(fā)光細(xì)菌的抑制大大降低(發(fā)光抑制率36.9%±3.4%),表明CYP和DEL經(jīng)菌株HS-10降解后,其毒性顯著降低。

表1 CYP和DEL降解前后發(fā)光抑制率(n=3)Tab.1 The light inhibition ratio of CYP and DEL before and after degradation(n=3)

進(jìn)一步采用核磁共振對(duì)CYP和DEL降解前后的產(chǎn)物進(jìn)行研究,如圖8所示,經(jīng)HS-10處理的農(nóng)藥樣品,其核磁共振圖譜發(fā)生了明顯變化,譜峰顯著減小,尤其是化學(xué)位移δ= 3.70處的譜峰消失,表明CYP和DEL被菌株HS-10降解,其降解過程主要為分子中酯鍵的斷裂。

圖8 CYP、DEL及其降解產(chǎn)物的1H NMR波譜Fig.8 1H NMR spectrums of CYP,DEL and their degradation products

3 討論

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥作為人工合成的一類殺蟲劑,由于具有高效、廣譜、對(duì)溫血?jiǎng)游锏确前袠?biāo)生物毒性相對(duì)較低等特點(diǎn),近年來使用量穩(wěn)步上升,導(dǎo)致流失到環(huán)境中的農(nóng)藥殘留總量增加(張松柏等,2009;劉麗等,2013)。通常,自然條件下農(nóng)藥的降解方式主要有生物降解、光化學(xué)降解和化學(xué)降解等(李玲玉等,2010),然而,目前使用的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥有些具有較強(qiáng)的光、熱穩(wěn)定性,且大多數(shù)農(nóng)藥殘留進(jìn)入水體沉積物中,由于沉積物環(huán)境具有避光、缺氧等特點(diǎn),農(nóng)藥往往更加不易降解、持久性增強(qiáng)(Liuet al,2005),因此,微生物降解是海水養(yǎng)殖環(huán)境中農(nóng)藥污染修復(fù)的有效方式。

大多數(shù)研究表明,獲得的降解菌株通常僅針對(duì)一種或少數(shù)幾種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,并對(duì)高濃度農(nóng)藥表現(xiàn)較低的耐受性,尤其是生物降解的實(shí)質(zhì)是酶促反應(yīng),單一微生物在降解農(nóng)藥時(shí)通常不具備生物降解所需的全部酶系,不能完全礦化農(nóng)藥殘留,往往會(huì)產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物,對(duì)菌體的生長(zhǎng)及降解性能產(chǎn)生影響(李青云等,2009;廖敏等,2009)。為此,本實(shí)驗(yàn)采用發(fā)光細(xì)菌方法對(duì)菌株 HS-10降解產(chǎn)物的毒性情況進(jìn)行了研究,并結(jié)合GC-ECD和NMR方法對(duì)HS-10的降解特性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明其降解產(chǎn)物毒性大大降低,未發(fā)現(xiàn)有毒代謝中間產(chǎn)物產(chǎn)生。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,菌株HS-10對(duì)CYP、DEL、BIF、CYF和FEN 5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥混合物(其濃度分別為100mg/L)具有較高的降解效率,其降解率分別為53.8%、72.1%、57.7%、50.4%和 66.6%,表明菌株HS-10對(duì)多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有較高的降解能力,表現(xiàn)出較好的應(yīng)用開發(fā)前景。

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