液基細(xì)胞制片術(shù)在纖維支氣管鏡抽吸物檢測(cè)中的應(yīng)用＊

萬(wàn) 濤，黃習(xí)臣，粟 毅，李岱容

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400016）

纖維支氣管鏡檢查是診斷肺部占位病變的主要方法，尤其對(duì)肺癌的診斷有著重要作用，通過(guò)對(duì)病變部位支氣管進(jìn)行抽吸、刷片、灌洗以及鉗取組織等手段獲取該部位細(xì)胞或組織標(biāo)本，通過(guò)細(xì)胞病理或組織病理學(xué)檢測(cè)，得到對(duì)病變性質(zhì)的最終確診。過(guò)去纖維支氣管鏡獲取的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本一般采用直接涂片的方法進(jìn)行檢查，該方法所制備的涂片厚薄不一，且常混有黏液等雜質(zhì)，易發(fā)生人為的異常變化，影響對(duì)惡性細(xì)胞的觀察而延誤臨床診斷與治療。隨著液基細(xì)胞制片技術(shù)的出現(xiàn)，很好地解決了傳統(tǒng)涂片的一些缺點(diǎn)。本研究將該技術(shù)用于纖維支氣管鏡抽吸物的檢測(cè)，能夠加強(qiáng)整個(gè)制片過(guò)程的質(zhì)量控制，獲得優(yōu)良的細(xì)胞薄片，提高了診斷的陽(yáng)性率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年2～10月在本科纖維支氣管鏡室進(jìn)行支氣管鏡檢查的門診或住院患者2 000例，其中男1 358例，女642例，年齡16～84歲，平均58歲。纖支鏡抽吸物行常規(guī)涂片及液基細(xì)胞制片。所有病例中967例具有組織學(xué)對(duì)照（包括經(jīng)纖支鏡鉗取、經(jīng)皮肺穿刺活檢及手術(shù)后病檢），其中經(jīng)組織病理學(xué)明確診斷肺癌567例。

1.2 儀器與試劑 LBP液基細(xì)胞制片系統(tǒng)（廣州安必平公司），包括半自動(dòng)樣本轉(zhuǎn)移機(jī)、離心機(jī)、振蕩器、染色板、一次性耗材包括液基細(xì)胞保存液、12mL離心管、過(guò)濾器、黏液消化液、黏附載玻片、移液器、蘇木素染液等，自備試劑：Tris緩沖液、伊紅、無(wú)水乙醇、二甲苯。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 內(nèi)鏡室醫(yī)師將纖維支氣管鏡檢查過(guò)程中的抽吸物或適量灌洗液注入液基瓶?jī)?nèi)，擰緊瓶蓋并搖勻，作好標(biāo)識(shí)后送細(xì)胞室檢查。每例標(biāo)本同時(shí)拉片制備兩張常規(guī)片一同送檢。

1.3.2 制片染色 根據(jù)安必平（LBP）沉降式液基細(xì)胞制片系統(tǒng)操作規(guī)程進(jìn)行制片，HE染色。

1.3.3 封片 染色完成后，玻片經(jīng)無(wú)水乙醇脫水，再放入二甲苯內(nèi)進(jìn)行透明處理，保持濕片，中性樹(shù)膠封固。

1.3.4 細(xì)胞學(xué)診斷 采用5級(jí)分類診斷法，即將細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為惡性細(xì)胞陽(yáng)性、可疑惡性細(xì)胞、惡性細(xì)胞不確定、惡性細(xì)胞陰性和標(biāo)本不滿意。肺癌細(xì)胞分為鱗癌細(xì)胞、腺癌細(xì)胞、小細(xì)胞癌細(xì)胞及未定型癌細(xì)胞。所有涂片結(jié)果均由同一人閱片診斷。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 鏡檢結(jié)果 液基細(xì)胞制片背景清晰，黏液雜質(zhì)少。由于細(xì)胞固定及時(shí)，保存較好，立體感強(qiáng)，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞比常規(guī)涂片的細(xì)胞小，核染色質(zhì)略深。液基涂片中鱗癌細(xì)胞體積大，有明顯異形性，核／質(zhì)比例增大，核居中央，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，可見(jiàn)較大的核仁濃染，固縮；有的染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀、細(xì)胞質(zhì)豐富粉染，高分化鱗癌細(xì)胞似蝌蚪形、纖維形或蛇形。腺癌細(xì)胞則呈單個(gè)、腺樣聚集，大圓形、多角形及柱狀，雙核或多核細(xì)胞常見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)淡染透明，核／質(zhì)比例增大，核居中心或偏位，染色質(zhì)中細(xì)顆粒狀，有明顯核仁；也有呈乳頭狀或管狀腺樣排列或三五成群，群內(nèi)細(xì)胞互相重疊形成立體三維結(jié)構(gòu)，清晰、多層面，癌細(xì)胞凸現(xiàn)。小細(xì)胞癌表現(xiàn)為疏松的和不規(guī)則的或合胞體樣的細(xì)胞簇，也可表現(xiàn)為單個(gè)散在密布，每1個(gè)腫瘤細(xì)胞的核／質(zhì)比較高，甚至為裸核，外形呈卵圓形至不規(guī)則形。同時(shí)，數(shù)例涂片中分別發(fā)現(xiàn)真菌菌絲及孢子和干酪樣壞死（經(jīng)病檢或抗酸染色證實(shí)為結(jié)核）。鏡檢結(jié)果詳見(jiàn)圖1、2。

圖1 液基薄片鏡下所見(jiàn)

圖2 液基細(xì)胞制片后進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)

2.2 液基細(xì)胞制片結(jié)合傳統(tǒng)涂片的細(xì)胞學(xué)檢出率 2 000例細(xì)胞學(xué)標(biāo)本共檢出陽(yáng)性614例，檢出率30.7%。細(xì)胞學(xué)分型情況，見(jiàn)表1。

表1 2 000例細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果

2.3 液基細(xì)胞制片與傳統(tǒng)涂片結(jié)果的比較 通過(guò)液基細(xì)胞制片技術(shù)和傳統(tǒng)涂片分別處理纖維支氣管鏡 抽吸標(biāo)本，567例肺癌病例中液基細(xì)胞制片診斷366例，經(jīng)常規(guī)涂片診斷279例。二者診斷肺癌的敏感性分別為64.6%（366／567）和49.2%（279／567）；液基細(xì)胞制片檢測(cè)肺癌的敏感性高于傳統(tǒng)涂片，而二者結(jié)合對(duì)肺癌檢測(cè)敏感性為69.7%，高于兩種方法單獨(dú)使用的敏感性，見(jiàn)表2。

表2 液基制片與傳統(tǒng)涂片結(jié)果比較

3 討 論

對(duì)可疑的肺癌患者進(jìn)行纖維支氣管鏡檢查時(shí)，通常采取刷檢、支氣管灌洗、鉗取組織活檢等方法獲取組織或細(xì)胞學(xué)證據(jù)，但這幾種取材方法各自有其缺點(diǎn)和不足，刷檢獲得的標(biāo)本較少，灌洗則導(dǎo)致標(biāo)本稀釋，而當(dāng)鏡下未見(jiàn)明確新生物時(shí)，鉗取組織活檢陽(yáng)性率較低。利用塑膠管經(jīng)纖支鏡活檢孔插入病變部位抽吸分泌物進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查，能夠獲得來(lái)自病變部位較多的標(biāo)本，而對(duì)于解剖結(jié)構(gòu)處于遠(yuǎn)端，纖支鏡不能到達(dá)的周圍型肺癌，通過(guò)負(fù)壓吸引可以獲得來(lái)自遠(yuǎn)端支氣管的分泌物，使肺癌的陽(yáng)性檢出率得到提高[1]。

傳統(tǒng)支氣管黏膜細(xì)胞學(xué)檢查是在纖維支氣管鏡檢查過(guò)程中，將取自于病變部位的標(biāo)本直接在普通玻片上涂片，這種涂片中細(xì)胞多層重疊甚至被黏液覆蓋，細(xì)胞受機(jī)械力等因素影響發(fā)生人為的變異，從而影響了診斷的準(zhǔn)確性。而液基細(xì)胞涂片背景比較干凈，細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)保持良好，纖毛上皮細(xì)胞表面的纖毛十分清楚，細(xì)胞內(nèi)核染色質(zhì)清晰，明顯提高了涂片質(zhì)量和檢出率[2-5]。本研究中利用液基細(xì)胞制片技術(shù)，診斷的敏感性為64.6%，高于傳統(tǒng)涂片檢測(cè)的敏感性49.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。尤其對(duì)于小細(xì)胞癌的診斷，液基細(xì)胞制片具有明顯的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，根據(jù)需要，保存在液基瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞可以制作多張涂片，同時(shí)可進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢查（圖2）及用于基因檢測(cè)為靶向治療提供參考[6-7]。

雖然液基細(xì)胞制片技術(shù)克服了傳統(tǒng)涂片的一些缺點(diǎn)，提高了纖維支氣管鏡抽吸物癌細(xì)胞檢測(cè)的陽(yáng)性率[8-9]，但是傳統(tǒng)涂片也有其優(yōu)點(diǎn)，如能夠及時(shí)得到固定，細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存完整，可有效避免“景深”現(xiàn)象，方便醫(yī)師進(jìn)行顯微鏡觀察，同時(shí)也有利于拍攝。本研究采用的沉降式液基細(xì)胞制片術(shù)，所制涂片中細(xì)胞不在同一平面，觀察時(shí)須不停轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)，不易拍出清晰而高度集中的細(xì)胞群體圖像[10-12]。本研究中也有19例液基細(xì)胞制片診斷為陰性，而通過(guò)傳統(tǒng)涂片得到診斷，這說(shuō)明傳統(tǒng)方法并不能被完全否定，兩者結(jié)合，能最大限度提高纖維支氣管鏡細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和陽(yáng)性檢出率。

同時(shí)，筆者在液基片中還發(fā)現(xiàn)多例真菌感染的標(biāo)本以及結(jié)核病典型的干酪樣壞死背景，真菌菌絲及孢子經(jīng)HE染成淡紅，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)保持良好，說(shuō)明液基細(xì)胞技術(shù)不破壞真菌結(jié)構(gòu)，能夠使其沉降黏附于載玻片上，從而為真菌感染提供診斷依據(jù)。另外在液基片中可見(jiàn)紅色淡染的片狀壞死背景，多為結(jié)核病典型的干酪樣壞死物，這類標(biāo)本往往提示可能存在結(jié)核，本研究中有35例后經(jīng)抗酸染色或病理組織活檢證實(shí)為結(jié)核菌感染。因此，當(dāng)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)過(guò)程中涂片內(nèi)出現(xiàn)這類壞死，可以結(jié)合患者臨床情況，進(jìn)一步行抗酸染色或病檢，提高結(jié)核菌的檢出率。

綜上所述，液基細(xì)胞制片技術(shù)應(yīng)用于纖維支氣管鏡抽吸物的檢測(cè)當(dāng)中，能夠克服傳統(tǒng)涂片的一些缺點(diǎn)，提高細(xì)胞學(xué)診斷的陽(yáng)性率，但是，傳統(tǒng)涂片仍有應(yīng)用于實(shí)際工作中的必要，兩者同時(shí)應(yīng)用能更好地彌補(bǔ)相互之間的不足，提高總體檢測(cè)的陽(yáng)性率。并能為真菌和結(jié)核菌感染提供形態(tài)學(xué)依據(jù)，為臨床此類疾病診斷提供幫助。同時(shí)液基細(xì)胞制片能夠更好地保存細(xì)胞，為后續(xù)復(fù)檢及進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)、基因檢測(cè)等提供樣本，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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