采用Changliver細胞制備肝細胞脂肪變性模型的方法探索＊

阿卜力克木·奧布力，程 磊，黃鳳玲，閆 冬，迪麗阿熱姆·尼加提，帕爾哈提·克熱木，魏媛媛

（新疆醫(yī)科大學(xué)：1.藥理學(xué)教研室；2.臨床專業(yè)2009級本科生；3.生理學(xué)教研室，烏魯木齊830011）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率逐年增加，在較短的時間內(nèi)可發(fā)展為不可逆的肝損害，例如：肝纖維化可達25%，肝硬化可達1.5%～8.0%，現(xiàn)已成為影響健康的重大隱患[1]。目前研究NAFLD的體外細胞模型主要采用油酸（oleic acid，OA）誘導(dǎo)肝細胞造成脂肪沉積，多選用肝癌細胞HepG2作為建模對象，因其具有腫瘤學(xué)特性，易于培養(yǎng)、傳代及反復(fù)凍存[2-5]。采用人正常細胞建立脂肪變性模型的較少，利用Changliver肝細胞建模尚未見報道。由于NAFLD的肝細胞脂肪變性通常發(fā)生在正常細胞而非腫瘤細胞上，因此探索正常肝細胞株的建模方法更具有實用性。本研究選擇Changliver張氏肝細胞株，利用OA誘導(dǎo)，明確其建模所需的具體濃度，作用時間等實驗條件。為研究NAFLD提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Changliver張氏肝細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞所，胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司、DMEM細胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司、三酰甘油（TG）測定試劑盒購自英科新創(chuàng)生物工程公司，胰酶、油酸、噻唑藍（MTT）粉、蛋白定量試劑盒、油紅O均購自美國Sigma公司。全自動酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Bio-Rad公司，倒置相差免疫熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Changliver張氏肝細胞株置于10%FBS，DMEM完全培養(yǎng)基4mL，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞達80%～90%密度時傳代，24～48h傳1次，按細胞的多少約1∶2或1∶3傳代于新的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。細胞生長穩(wěn)定良好即可使用。將Changliver細胞以104個／孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔內(nèi)加入含細胞培養(yǎng)基200μL，在37℃，5%CO2孵箱孵育24h。

1.2.2 OA 造模濃度的確立 分別用 DMSO 和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0mmol／L不同濃度 OA 干預(yù)后（每組樣本數(shù)為6），予油紅O染色，分別于24、48h和72h3個時間點進行鏡下觀察，依據(jù)MTT結(jié)果，脂變率及鏡下細胞脂變程度確定OA作用的最佳濃度和作用時間并作為模型組的OA濃度。

1.2.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察 每日用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的生長狀況及形態(tài)變化。組織學(xué)中當(dāng)肝細胞內(nèi)脂滴形成超過5%可定義為脂肪肝[6]。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法檢測細胞活力 將Changliver細胞接種于96孔培養(yǎng)板，置于10%FBS RPMI-1640完全培養(yǎng)基5mL。當(dāng)細胞達80%～90%密度時傳代，24～48h傳1次，按細胞的多少約1∶2或1∶3傳代于新的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。細胞進入指數(shù)生長期后將Changliver細胞以104個／孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔內(nèi)加入含細胞培養(yǎng)基200 μL，在37℃，5%CO2孵箱孵育24h。觀察細胞貼壁情況。分別設(shè)對照組和各濃度 OA組（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0mmol／L），每組設(shè)6個復(fù)孔。各組細胞分別于作用24、48、72h時，于每孔加入20μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入二甲亞砜（DMSO）溶液100 μL，置于微板振蕩器震蕩10min，以使結(jié)晶物充分溶解。全自動酶標(biāo)儀490nm處測量各孔的吸光度值（A值）。記錄結(jié)果，并以時間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。

1.2.5 細胞各時間點脂變率的計算 光鏡下觀察油紅O染色的細胞片，并對脂肪變性細胞計數(shù)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)生脂肪變性的細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)橘紅色脂滴；記錄標(biāo)準(zhǔn)：隨機選取6個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算其平均脂變率。

1.2.6 細胞內(nèi)TG的檢測 將Changliver細胞接種于6孔板，按上述分組予以處理，24h后收集細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次，加入RIPA細胞裂解液震蕩，冰上放置30 min，待細胞充分裂解，4℃，14 000r／min離心10min并取上清液。采用BCA法檢測蛋白含量。以氧化酶法檢測TG的含量，于波長500～550nm處，空白孔調(diào)零，測A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算TG濃度。計算結(jié)果表示為每克細胞總蛋白中所含的TG量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡觀察可見對照組細胞排列緊密，邊緣清晰。經(jīng)OA誘導(dǎo)后，Changliver細胞明顯生長旺盛，邊緣尚清晰。且較多細胞變圓、核大，部分細胞核被擠到一側(cè)，類似印戒樣改變。

2.2 MTT法檢測細胞活力OA濃度0.2mmol／L 時，Changliver細胞的增殖幾乎不受抑制，細胞增殖程度跟空白組接近，隨著OA濃度的升高和時間的增長，其細胞增殖受到不同程度的抑制，見表1、圖1。

表1 不同濃度OA在不同時間點對Changliver細胞活力的影響 （A值，±s）

表1 不同濃度OA在不同時間點對Changliver細胞活力的影響 （A值，±s）

6 0.605±0.037 0.630±0.039 0.645±0.038對照組 6 0.619±0.046 0.627±0.042 0.662±0.018 0.2mmol／L OA組 6 0.610±0.013 0.613±0.018 0.616±0.019 0.4mmol／L OA組 6 0.619±0.003 0.524±0.006 0.426±0.006 0.6mmol／L OA組 6 0.604±0.014 0.521±0.009 0.414±0.013 0.8mmol／L OA組 6 0.551±0.054 0.490±0.027 0.357±0.052 1.0mmol／L OA組 6 0.550±0.013 0.484±0.013 0.379±0.021 2.0mmol／L OA組 6 0.556±0.041 0.424±0.049 0.322±0.050 3.0mmol／L OA組 6 0.516±0.018 0.345±0.046 0.340±0.038 4.0mmol／L OA組24h 48h 72h DMSO組組別 n 6 0.485±0.059 0.342±0.042 0.309±0.023

2.3 油紅O染色觀察結(jié)果 油紅O染色結(jié)果顯示，對照組細胞核呈紫藍色，邊緣清晰，細胞內(nèi)未見明顯橘紅色脂滴（圖2），OA濃度為0.2mmol／L和0.4mmol／L時，油紅 O染色見細胞內(nèi)充滿大小不等的橘紅色脂滴，有些甚至融合（圖3、4）。OA濃度0.6、0.8、1.0、2.0mmol／L時，隨著濃度的升高，細胞內(nèi)脂滴增多，同時OA對細胞的毒性也增加，細胞邊緣不清晰，形狀不規(guī)則，數(shù)量減少（圖9、10）。Changliver細胞各濃度和時間點脂變率的比較，見表2。根據(jù)結(jié)果確定Changliver細胞建立脂肪變性條件為0.2mmol／L OA培養(yǎng)細胞24h。

圖1 不同OA濃度下Changliver細胞生長曲線

圖2 對照組油紅O染色（×200）

圖3 0.2mmol／L OA組油紅 O染色（×200）

圖4 0.4mmol／L OA組油紅 O染色（×200）

圖5 0.6mmol／L OA組油紅 O染色（×200）

圖6 0.8mmol／L OA組油紅 O染色（×200）

圖7 1.0mmol／L OA組油紅 O染色（×200）

圖8 2.0mmol／L OA組油紅 O染色（×200）

表2 各濃度OA作用下Changliver細胞不同時間點的脂變率（±s，%）

表2 各濃度OA作用下Changliver細胞不同時間點的脂變率（±s，%）

24h 48h 72h 0.2mmol／L OA組組別 n 6 76.34±3.38 78.54±3.86 80.03±4.19 0.4mmol／L OA組6 79.65±3.76 71.24±3.65 67.26±3.76

續(xù)表2 各濃度OA作用下Changliver細胞不同時間點的脂變率（±s，%）

續(xù)表2 各濃度OA作用下Changliver細胞不同時間點的脂變率（±s，%）

24h 48h 72h 0.6mmol／L OA組組別 n 6 80.36±4.41 58.41±2.89 51.14±2.53 0.8mmol／L OA組 6 64.82±5.46 59.30±2.73 53.57±3.02 1.0mmol／L OA組 6 55.04±3.09 46.24±2.13 42.79±2.21 2.0mmol／L OA組 6 55.68±4.10 42.64±2.79 40.25±3.50 3.0mmol／L OA組 6 51.66±3.81 34.45±2.46 30.40±2.38 4.0mmol／L OA組6 41.53±2.59 29.42±3.02 22.49±2.63

2.4 Changliver細胞內(nèi)TG含量的變化 Changliver細胞模型組與對照組比較，TG含量顯著增高（P＜0.01）；符合NAFLD的細胞模型要求。

圖9 3.0mmol／L OA組油紅 O染色（×200）

圖10 4.0mmol／L OA組油紅O染色（×200）

表3 石榴花多酚對OA誘導(dǎo)脂肪變形細胞內(nèi)TG的影響（±s）

表3 石榴花多酚對OA誘導(dǎo)脂肪變形細胞內(nèi)TG的影響（±s）

＃：P＜0.01，與對照組比較。

組別 n TG（mg／g）6 185.03±12.68 0.2mmol／L OA 組 6 379.98±23.19對照組＃

3 討 論

目前，制備肝細胞脂肪變模型的常用細胞是肝癌細胞HepG2和正常肝細胞L02。本研究選用人正常肝細胞株Changliver細胞進行脂肪肝模型的制備，因其分化特性與正常肝細胞相似，具有L02細胞所沒有的無限傳代的特點，且培養(yǎng)方法與原代細胞相比相對簡單，但不屬于腫瘤細胞。因此，實驗結(jié)果更接近于由正常肝細胞發(fā)展而來的非酒精性脂肪肝在體模型的特點，是體外研究NAFLD較為理想的細胞模型。但目前尚無關(guān)于Changliver細胞脂肪變建模的報道。

OA是一種單不飽和脂肪酸，主要存在于植物油中，又被稱作十八（碳）烯酸。研究表明，肝細胞可攝取在鏈長為C12～C18的長鏈脂肪酸，將其酯化成中性脂滴后，儲存于肝細胞內(nèi)。依據(jù)此原理Yasuyuki等[7]首次應(yīng)用OA誘導(dǎo)HepG2細胞24 h后，成功造成人源性肝細胞株的脂肪變性模型。楊林輝等[8]應(yīng)用低濃度OA誘導(dǎo)L02細胞72h，建立肝細胞脂肪變性模型。

本實驗選用不同濃度OA誘導(dǎo)Changliver細胞，在不同的時間點通過MTT檢測和油紅O染色明確建模所需的最佳誘導(dǎo)濃度和時間，依據(jù)MTT檢測、油紅O染色和TG檢測驗證，0.2mmol／L濃度OA作用細胞24h，細胞脂變明顯。隨著誘導(dǎo)時間的延長，超過48h后，脂滴不再增加反而減少。當(dāng)OA≥0.2mmol／L時，脂變雖然有所增加，但細胞受損程度也逐漸增加，與楊林輝等[8]在制備HepG2脂肪肝細胞造模中的現(xiàn)象相似。提示OA對細胞有一定的毒性，有研究認為當(dāng)肝細胞內(nèi)不飽和脂肪酸蓄積，可通過細胞色素P4502E1酶途徑引起脂質(zhì)過氧化，進一步促進細胞凋亡從而產(chǎn)生細胞毒性[9]。Cui等[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)OA誘導(dǎo)后的肝細胞中超氧化物酶-1（SOD-1）含量明顯減少，這種自由基清除酶可以在脂質(zhì)過氧化過程中保護細胞膜免受自由基的攻擊。因此OA的細胞毒性與脂質(zhì)過氧化及細胞的抗氧化能力降低有關(guān)。

綜上所述，本實驗造模方法所需時間較短，且細胞來源方便，性質(zhì)穩(wěn)定，是一種研究NAFLD的理想方法。

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