總免疫球蛋白E時間分辨熒光免疫分析法的建立與評價＊

譚玉華，孫寶清

（廣州醫科大學附屬第一醫院廣州呼吸疾病研究所／呼吸疾病國家重點實驗室，廣州510120）

免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）在血清中含量極微，僅占血清免疫球蛋白總量的0.002%，但它卻是引起過敏反應的主要抗體。自1966年日本學者Ishizaka發現IgE以來，開啟了過敏性疾病研究的新時代。總IgE（total IgE，TIgE）的測定已在臨床廣泛應用，它已成為過敏性疾病診斷與鑒別診斷、寄生蟲感染性疾病、免疫功能障礙相關性疾病的實驗室評估指標。隨著環境的改變，在生活中接觸到的食物、藥物、化學物質等越來越多，過敏原也就越來越復雜多樣，可達數千種，而且很隱蔽。雖然目前已有多種國際先進的過敏原檢測系統，但仍難將所有過敏原全部涵蓋。TIgE檢測對這類無法確定具體過敏原的過敏癥患者仍具有極大的幫助。TIgE的體外定量檢測可為判定機體對過敏原的易感性提供了有價值的信息[1]，TIgE是特應性體質的客觀指標。據文獻報道，血清TIgE水平的高低還與疾病嚴重程度有關，測定TIgE含量有助于對病情嚴重程度的判定從而對急性發作期臨床治療療程、緩解期預防性用藥療程進行指導[2]。IgE在過敏性疾病診斷中的作用已獲得公認，但血清中IgE的含量較低，特別是新生兒臍帶血中IgE含量極低，必須用靈敏的方法才能正確檢測。建立一個高度敏感同時又非常特異的檢測系統是開展人IgE抗體免疫調節機理研究的基本前提和難點之一。目前，時間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA）已成為生物醫學研究和臨床超微量生化檢驗中一項最有發展前景的分析手段。因此，筆者基于雙抗體夾心法建立了TIgE TRFIA法，并對其性能進行了評價，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 按照《全國臨床檢驗操作規程》（第3版）采集靜脈血，樣本如其干擾限超過試劑盒說明書給定范圍或樣本污染等均應予以剔除。收集用于方法學比對試驗預期偏倚評估的隨機樣本共40例，其待測物濃度應覆蓋方法學的檢測范圍，且盡可能均勻分布；健康成人樣本來自健康體檢正常者的血清樣本共20例，用于參考值的轉移接收的驗證試驗；確診為過敏性疾病患者的樣本80例，用于評價TIgE在過敏患者樣本中的檢出率及方法學檢測結果間的一致性。

1.2 儀器與試劑 TAKEEN-Ⅰ型TRFIA儀、FWZ-Ⅰ型微量振蕩器、DEM-Ⅲ型全自動洗板機（廣州市豐華生物工程有限公司）；酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；VictorTM2D1420型TRFIA儀（芬蘭Wallac Oy公司）。羊抗人IgE多克隆抗體（深圳菲鵬生物股份有限公司）；鼠抗人IgE單克隆抗體（美國Advance公司）；人IgE純品（英國Abcam公司）；牛血清清蛋白（BSA）和Tween20（美國Sigma公司）；Sepharose CL-6B凝膠（瑞典Pharmacia公司）；96孔微孔板（深圳金燦華實業有限公司）；銪（Eu3＋）標記試劑盒（芬蘭 Wallac Oy公司）；帶有濾膜的離心管（美國Millipore公司）；其余試劑為國產分析純試劑；自制以β-萘甲酰三氟丙酮為主要成分的增強液；自制含0.4%（V／V）的 Tween20為主要成分的 pH 7.8 200 mmol／L Tris-HCl溶液為濃縮洗滌液；自制含10%（V／V）的小牛血清和0.01g／L乙二胺四乙酸二鈉為主要成分的pH 7.8 50mmol／L的Tris-HCl溶液為實驗緩沖液；自制含50g／L BSA的50mmol／L、pH 7.8的Tris-HCl緩沖液為校準品稀釋液或樣本稀釋液。300mg／mL的IgA、IgG、IgM，160g／L的清蛋白，1 000IU／mL的甲胎蛋白，800IU／mL的類風濕因子，低、中、高3個濃度的質量控制品（廣州市豐華生物工程有限公司）；IgE國際標準品（WHO 2ndIRP75／502；5 000IU／安培）（英國NIBSC）；TIgE檢測ELISA試劑盒（德國歐蒙醫學實驗診斷股份公司）。

1.3 方法

1.3.1 校準品的制備 以 WHO 2ndIRP 75／502為對照，人IgE純品用含50g／L BSA的50mmol／L、pH 7.8的 Tris-HCl緩沖液定量稀釋成0.0、2.4、12.0、60.0、300.0、1 500.0IU／mL（分別用A～F表示）。

1.3.2 固相反應板的制備和最適包被濃度的選擇 將羊抗人IgE多克隆抗體用50mmol／L、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋成包被液（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg／mL），在固相微孔板加入100μL抗體包被液，以上濃度各包被1塊，4℃冰箱孵育過夜，洗滌1次，再每孔中加入含10g／L BSA的50mmol／L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）250μL，37℃恒溫箱孵育2h封閉，甩干后晾干，真空封膜，4℃冰箱保存備用。采用方陣（棋盤）滴定法，在2.0～6.0μg／mL預包被的反應板上，檢測校準品A、校準品F 2個濃度點的熒光值強度（CPs）。選取校準品A本底熒光值（N）較低，且校準品F的檢測熒光值（P）與N的比值（P／N）最大的包被濃度為最適包被濃度。確定最適包被濃度后按以上方法制備固相反應板。

1.3.3 銪標記物的制備和最佳稀釋度的選擇 將1mg的鼠抗人IgE單克隆抗體加入Millipore公司的帶有濾膜的離心管中，10 000r／min離心9～10min。再用標記緩沖液（50mmol／L、pH 9.3的碳酸鹽緩沖液）重復洗滌3～5次。將收集到的200μL鼠抗人IgE單克隆抗體和1mg的銪標記試劑充分混勻，4℃振蕩反應（24±2）h。反應液經50mmol／L、pH 7.80 Tris-HCl緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱（1cm×30cm）層析，每管2.0mL，A280監測收集第一洗脫峰。合并峰管，根據Eu3＋標記試劑盒說明書所提供的公式計算標記率和回收率。蛋白相對分子質量為160 000的單克隆抗體的理想標記Eu3＋個數為6～10個／蛋白分子。將銪標記物用實驗緩沖液按體積比1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000稀釋，檢測校準品 A、校準品F 2個濃度點的CPs。選取N較低，且P／N最大的稀釋度為銪標記物最佳稀釋度。

1.3.4 TIgE TRFIA方法學的建立 為了盡量避免 HOOK效應，選用雙抗體夾心二步法。檢測方法應適用于普通實驗室條件下，反應宜選擇室溫20～25℃條件。第1步：在固相微孔反應板中依次加入10μL的校準品或樣本或質量控制品，再每孔中加入100μL樣本稀釋液，在室溫條件下振蕩孵育（30、45、60、75min），洗板5次拍干。第2步：在每孔中加入100μL銪標記物工作液，在室溫條件下振蕩孵育（30、45、60、75min），洗板5次拍干。然后在每孔中加入100μL增強液，在室溫條件下振蕩（1、2、3、4、5、10、30、40min），將反應板放入 TRFIA 儀內進行熒光計數。選擇檢測校準品A～F熒光值接近平衡的反應時間作為最適反應時間。

1.3.5 性能評價 參考文獻[3-4]對劑量-反應曲線擬合模型進行優選。參考NCCLS的指南及有關文獻[5-14]對精密度、檢測低限、線性、準確度（校準品核對試驗、回收試驗）、特異性（交叉反應試驗、干擾試驗）、參考值確認、方法學比對等進行評價。

1.4 統計學處理 TRFIA測量所得熒光計數采用TRFIA儀上隨機配備的分析軟件進行數據分析。其他統計數據采用SPSS13.0和Microsoft Excel軟件進行分析。

2 結 果

2.1 銪標記鼠抗人IgE抗體的鑒定 銪標記鼠抗人IgE抗體A280監測收集，收集銪標記物峰（5～8管）。銪標記鼠抗人IgE抗體的回收率為92.51%，表明分離純化后的抗體損失較少。以芬蘭Wallac Oy公司標準Eu3＋為參考，銪標記物峰的銪標記鼠抗人IgE抗體中的Eu3＋含量為6.06μmol／L，蛋白含量為0.72μmol／L，計算可得平均每個鼠抗人IgE抗體上連接了8.40個Eu3＋，達到了理想的標記率。

2.2 方法學的建立

2.2.1 最適包被濃度和銪標記物最佳稀釋度 經方陣（棋盤）滴定法，當以4.0μg／mL包被反應板和銪標記物按1∶1 500稀釋時，本底良好（＜2 000）且校準品F檢測熒光值的S／N值趨于最大，因此最適包被濃度為4.0μg／mL，銪標記物最佳稀釋度為1∶1 500。

2.2.2 反應動力學 當第1、2步的反應時間分別為60min和45min，檢測校準品A～F的熒光值趨于“飽和”，曲線斜率趨于最大，表明反應趨于完全。解離增強振蕩5min時，校準品A～F的熒光值已趨于平衡，表明Eu3＋已從銪標記物螯合物上充分解離下來，與增強液成分形成了穩定的復合物。

2.2.3 建立劑量-反應曲線 按優化的反應條件進行試驗[3-4]，劑量-反應曲線擬合優選Log＿LogB雙對數數學模式及三樣條平滑（SPLINE）擬合時曲線平滑，擬合程度高，擬合后的曲線的r＞0.990 0，典型的劑量-反應曲線，見圖1。

圖1 TIgE TRFIA的劑量-反應曲線

2.3 分析性能評價

2.3.1 精密度 參考 NCCLS EP5-A文件[5]評價，低、中、高3個濃度的質量控制品批內和批間檢測的實測值分別為（4.03±0.07）IU／mL和（4.03±0.30）IU／mL，（90.57±1.44）IU／mL和（90.57±5.05）IU／mL，（319.55±5.33）IU／mL 和（319.55±16.70）IU／mL，批內和批間的變異系數（CV）分別為1.68%和7.33%，1.59%和5.57%，1.67%和5.23%。

2.3.2 檢測低限 參考文獻[6]評價，平行檢測校準品A 20次的熒光值（±s）為1 309＋156；95%CI（x±2s）為1 620，在劑量-反應曲線上擬合得到的濃度值為0.25IU／mL，優于歐蒙TIgE ELISA法試劑的檢測低限1IU／mL。

2.3.3 線性 參考 EP6-A 文件[7]評價，該方法在1.47～1 510.00IU／mL范圍內，其線性回歸方程為Y＝0.988 2X-0.068 8，r＝0.999 3（tr＝83.15，v＝9，P＜0.01），見圖2。本方法的線性上限高于歐蒙TIgE ELISA法試劑的線性上限500 IU／mL。

圖2 TIgE TRFIA的線性

2.3.4 校準品核對試驗 參考文獻[8-9]評價，以國際標準品的稀釋溶液（2.4～1 500.0IU／mL）為對照，測定TIgE TRFIA各校準品，以相對偏倚±10.00%為可接受范圍；TIgE TRFIA校準品A～F的實測值與標示值的相對偏倚在-5.57%～7.92%內。

2.3.5 回收試驗 將1份22IU／mL的常規檢測樣本分成3等份（各1mL），在其中2份中分別加入44IU／mL和110IU／mL的血清樣本0.1mL，制成加入濃度分別為4.0IU／mL和10.0IU／mL的2份待回收分析樣本，第3份中加入校準品稀釋液0.1mL制成基礎樣本血清，回收率在90.00%～110.00%范圍內為可接受。檢測基礎樣本和2份待回收分析樣本的實測濃度分別為19.41、24.21IU／mL和29.64IU／mL，2份待回收分析樣本的回收率分別為97.00%和106.75%，平均回收率為101.88%，比例系統誤差為1.88%。

圖3 血紅蛋白對樣本檢測結果的干擾程度

2.3.6 交叉反應 參考文獻[9-10]評價，檢測300mg／mL的IgA、IgG、IgM，160g／L的清蛋白，800IU／mL的類風濕因子，1 000IU／mL的甲胎蛋白，其實測濃度值分別為0.075、0.120、0.120、0.105、0.125IU／mL和0.040IU／mL，均未高于檢測低限0.25IU／mL，表明對TIgE TRFIA檢測結果無明顯交叉反應。

2.3.7 干擾試驗 參考 NCCLS EP7-A2文件[11]評價，分別選用低、中、高濃度的血清加入以下干擾物，干擾物質溶液與血清分別按體積比1∶9混合，組成系列干擾物濃度，對照血清加入干擾物相同體積的純化水，采用干擾率為±10.00%作為系統干擾物最高限。樣本中含血紅蛋白（≤18.00g／L），膽紅素（≤818.0mol／L），三酰甘油（≤21.54mmol／L），乙二胺四乙酸鉀（≤2.20mg／mL），草酸鉀（≤2.00mg／mL），肝素（≤15.00U／mL），枸櫞酸鈉（≤21.80mmol／L），氟化鈉（≤1.00mg／mL）對檢測結果干擾率均在±10.00%以內，見圖3～10。

圖4 膽紅素對樣本檢測結果的干擾程度

圖5 三酰甘油對樣本檢測結果的干擾程度

圖6 乙二胺四乙酸二鉀對樣本檢測結果的干擾程度

圖7 草酸鉀對樣本檢測結果的干擾程度

2.3.8 HOOK效應 將已知濃度的IgE純品稀釋成3.6～15 000.0IU／mL的系列濃度樣品，每稀釋濃度重復測定2次后取平均值。該方法檢測TIgE達15 000.0IU／mL時仍未見HOOK效應。

2.3.9 參考值驗證 歐蒙ELISA法試劑的參考值為100IU／mL（年齡大于16歲）。參考NCCLS C28-A2文件[12]及 WS／T 402-2012[13]，對參考值進行轉移接收驗證，檢測20例健康成人樣本，僅有1例結果（114.96IU／mL）高于100IU／mL，其他19例樣本在29.81～92.91IU／mL間，檢測值在引用參考區間的參考個體數與總的參考個體數的比率為95%，可以直接引用100IU／mL作為TRFIA檢測成人樣本TIgE的參考值，但是健康人群TIgE水平易受環境、種族、遺傳、年齡、檢測方法及取樣標準等因素的影響，各實驗室應建立自己的參考值或參考值驗證。

圖8 肝素對樣本檢測結果的干擾程度

圖9 枸櫞酸鈉對樣本檢測結果的干擾程度

圖10 氟化鈉對樣本檢測結果的干擾程度

2.3.10 方法學比對 參考NCCLS EP9-A2文件[14]進行預期偏倚評估試驗。參考美國CLIA′88規定的類似項目（IgG）的允許誤差（±25%）的1／2（即±12.50%），作為方法學可比性的臨床接受判斷標準。TIgE TRFIA與歐蒙ELISA平行檢測40份樣本（14.43～518.81IU／mL）結果的線性回歸方程為Y＝1.005 6X-0.153 4，r＝0.999 2（tr＝153.99，v＝38，P＜0.01）。選用歐蒙TIgE ELISA說明書上的各年齡階段的參考值作為給定值，TRFIA與歐蒙ELISA的測定結果的相對偏倚在-12.22%～0.48%內，均在可接受范圍（±12.50%）之內。2種方法在80例過敏性疾病患者樣本中均檢出61例（76.25%）TIgE高于臨界值100IU／mL，2種方法檢測結果的一致性符合率為100%。

3 討 論

目前應用于TIgE檢測的方法有免疫比濁法（ITM）、放射免疫法（RIA）、ELISA法、化學發光法（CLIA）、電化學發光法（ECLIA）、熒光免疫分析法（FIA）等。ITM是一類均相免疫測定法，但單純就靈敏度而言，RIA、ELISA及FIA法等均優于ITM法。因RIA具有放射性污染的固有缺陷，其市場占有率逐年下降，Gosling[15]在《Clinical Chemistry》發表的文章統計，國際上在免疫分析中采用同位素標記所占的比例由1980年的60%下降為1989年的25%，非同位素標記由1980年的不足40%上升為1989年的75%，近年來這個比例仍在變化。目前，臨床檢測TIgE常用的仍是ELISA法，但其靈敏度較低，線性范圍較窄，結果易受操作人員、實驗條件等因素的影響。由于一般FIA法中的本底較高等問題，傳統的FIA用于定量測定有一定困難。CLIA和ECLIA是目前的新型超微量免疫分析技術，但是CLIA發光過程短、樣品不能重復檢測、本底高及易受環境物質干擾。ECLIA盡管有一定優勢，但目前儀器和試劑均依賴進口，且非開放系統，造成試劑價格昂貴，儀器成本及維護費用高。近年來引進的熒光酶免疫法Pharmacia CAP變應原體外檢測系統，試劑價格昂貴，限制了其大量使用。

RIA、ELISA、傳統的FIA均沒有實現人們所期待的高靈敏度分析，因此科學家們努力尋求一種更可靠的標記物，自1979年Soini等[16]合成了一種可用于標記抗體的“Eu3＋、β-二酮體和EDTA衍生物”的三元混合物作為熒光探針并提出TRFIA理論，他們預言TRFIA將發展為新一代以鑭系元素為示蹤物和時間分辨熒光測量相結合的非放射性微量免疫分析技術。TRFIA因鑭系元素的熒光壽命可達60～900s，甚至更長，比普通熒光高數個數量級，在每個激發光脈沖過后，通過延時，門寬選擇，并通過濾光，以達到消除來自樣品、試劑及其他的非特異熒光，從而提高靈敏度，又因鑭系元素的激發光和發射光之間有一個較大的stokes位移，這有利于排除其他非特異熒光的干擾，方法的特異性較高。TRFIA將抗原抗體反應與熒光物質發光和時間分辨技術三者相結合，其靈敏度可達10-18mol／L。與現在廣泛使用的 RIA、ELISA、FIA、CLIA和ECLIA相比，TRFIA克服了RIA放射性污染的不足、酶標記物的不穩定性和定量范圍窄的缺陷、化學發光僅能一次發光、一般熒光標記受環境干擾的難點和電化學發光的非直接標記等缺點。

本研究應用Eu3＋標記建立的TIgE雙抗體夾心TRFIA，經方法學評價具有以下優點：（1）重復性好；（2）靈敏度高；（3）線性范圍寬；（4）準確度高；（5）特異性強；（6）與歐蒙 ELISA 比對檢測試劑線性范圍內的臨床樣本具有良好的相關性，2種方法檢測結果的一致性符合率為100.00%；在過敏性疾病患者中的TIgE的陽性檢出率達76.25%。表明TIgE的檢測在過敏性疾病篩選試驗中是一個重要參考指標，本研究建立的TIgE TRFIA能滿足臨床的需要。

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