地諾孕素對異位子宮內膜間質細胞凋亡的影響及其機制研究＊

劉曉娟，張玉虹，王 虹

（河北北方學院附屬第一醫院婦產科，河北張家口075000）

子宮內膜異位癥以子宮內膜組織的異位生長及相關的盆腔疼痛、痛經、和不孕不育為特點[1]，在育齡婦女中有約10%的發病率，近年來發病率明顯呈上升趨勢[2]。雖然關于子宮內膜異位癥的基礎研究和臨床研究取得了一定進展，但仍不明確其誘因和發病機制。現階段臨床治療方法主要是藥物或手術，由于患者多為育齡女性，手術治療有局限性；而藥物治療存在停藥復發[3]、干擾凝血和脂代謝等不良反應多的問題[4]。故而探究子宮內膜異位癥的發病機制并尋找到有效的治療方案，會給患者帶來福音。地諾孕素是選擇性黃體激素類藥物，2010年它與雌二醇復方作為避孕藥在美國上市。有研究表明，地諾孕素具有緩解子宮內膜異位癥疼痛、穩定子宮內膜組織的作用[5-8]。其作用效果相當于醋酸亮丙瑞林，但地諾孕素具有更好的耐受性，且不良反應率低。本實驗設計體外培養異位子宮內膜間質細胞，研究地諾孕素對子宮內膜異位癥的治療作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 地諾孕素（Bayer公司），胎牛血清（FBS，Gibco公司），DMEM（Hyclone公司），膠原酶（Invitrogen公司），細胞360目濾網（上海通善生物科技有限公司），鼠抗波形蛋白抗體（武漢博士德公司），SABC試劑盒（武漢博士德公司），噻唑藍（MTT，Sigma公司），二甲亞砜（DMSO，Sigma公司），碘化丙啶（PI，Sigma公司），抗體：β-actin（Human，Origene公司）、NF-κB（Human，Origene公司）、Bcl-2（Santa Cruz公司）和 Bcl-XL（Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 原代細胞來源于2013年6～12月，院中婦產科收治的術前無激素類藥物服用史的卵巢巧克力囊腫患者。取患者異位子宮內膜和正常子宮內膜組織，進行離體培養。將組織剪碎并用含有雙抗的D-Hanks液漂洗，加入4倍組織體積的膠原酶37℃消化1h，懸濁液過360目細胞濾網。濾液1 000r／m離心10min后，棄上清液用DMEM重懸，用含有20%FBS的DMEM培養基于37℃、80%相對濕度和5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 細胞鑒定 原代細胞胰酶消化后，加到含有蓋玻片的6孔板中，細胞貼壁長滿后加入4%多聚甲醛固定。用鼠抗波形蛋白抗體和SABC試劑盒做細胞免疫熒光檢測。

1.2.3 實驗分組 NSCS組：正常子宮內膜組織的原代細胞；NSCS-DNG組：用50nmol／L地諾孕素作用NSCS細胞；ECSC組：異位子宮內膜組織的原代細胞；ECSC-DNG組：用50 nmol／L地諾孕素作用ECSC細胞。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法測定地諾孕素對子宮內膜間質細胞的抑制作用 NSCS細胞和ECSC細胞消化后以5×104個／孔接種于24孔板中，培養過夜后正常地諾孕素組和異位地諾孕素組給予50nmol／L地諾孕素干預。給藥后在24、48h和72h用MTT法測細胞增殖。

1.2.5 流式細胞儀測定地諾孕素對子宮內膜間質細胞凋亡影響 細胞傳代于細胞培養瓶中，24h后正常地諾孕素組和異位地諾孕素組給與50nmol／L地諾孕素干預。藥物作用48h后收集各組細胞，調整細胞密度至1×106個／mL，用PI染色法測細胞凋亡率。

1.2.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測地諾孕素對子宮內膜間質細胞NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達的影響 50 nmol／L地諾孕素作用48h后棄去培養基，PBS洗細胞2次。加入含有PMSF的細胞裂解液RIPA，刮細胞，冰上裂解10 min。加入SDS緩沖液，100℃煮沸5min后，冰上冷卻5min后，4℃條件下12 000r／m離心5min，所得上清液用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，電轉移到硝酸纖維素膜上。NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL一抗工作液4℃孵育過夜后，用NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL二抗工作液37℃孵育30min，化學發光顯影。

1.3 統計學處理 實驗數據應用SPSS18.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示。組間差異采用t檢驗方法，多組差異進行單因素方差（one-way ANOVA）分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞鑒定 LEICA倒置熒光顯微鏡鏡檢，原代細胞培養24h后即可貼壁，細胞體積較大且多呈梭形。對細胞進行免疫熒光染色后，95%以上細胞的細胞質有綠色熒光。

2.2 地諾孕素對子宮內膜間質細胞的抑制作用 用MTT法檢測地諾孕素對子宮內膜間質細胞增殖的作用，如圖1所示。NSCS細胞和ECSC細胞都表現出隨時間的增殖趨勢，但ECSC細胞增殖率低于NSCS細胞。給予50nmol／L地諾孕素干預后，NSCS細胞和ECSC細胞都表現出了增殖抑制趨勢（P＜0.05），但地諾孕素對ECSC細胞抑制作用更強（P＜0.05）。

圖1 地諾孕素對子宮內膜間質細胞增殖的影響

2.3 地諾孕素對子宮內膜間質細胞凋亡的影響 實驗中采用流式細胞術對50nmol／L地諾孕素干預48h各組細胞進行凋亡檢測，檢測結果顯示：無地諾孕素干預時，NSCS細胞和ECSC細胞凋亡率低；當給予50nmol／L地諾孕素干預后，NSCS細胞 凋 亡 率 （6.16±0.54）%，NSCS-DNG 細 胞 凋 亡 率（43.41±3.77）%，ECSC細胞凋亡率（5.98±0.66）%，ECSC-DNG細胞凋亡率（69.57±5.71）%。NSCS細胞和ECSC細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），而且ECSC細胞凋亡率高于NSCS細胞（P＜0.05）。

2.4 地諾孕素對子宮內膜間質細胞NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達的影響 通過 Western blot法對NSCS組、NSCSDNG組、ECSC組和ECSC-DNG組進行 NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白檢測，發現：各組均有NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白條帶；與NSCS組比較，ECSC組NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達明顯增多，而NSCS-DNG組中NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達減少；與ECSC組比較，ECSC-DNG組中NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達顯著減少。

3 討 論

子宮內膜細胞的程序性凋亡對其保持正常結構和功能具有重要意義，其周期性變化實際上就是靠月經周期的分泌晚期及月經期的細胞凋亡來實現的。而子宮內膜異位癥患者的內膜細胞凋亡趨勢減弱，凋亡失去周期性。研究發現子宮內膜異位癥患者內膜較正常內膜具有更高的增殖率，且對凋亡調控不敏感[9]。Bcl-2等抗凋亡基因家族促進了子宮內膜異位癥的發生發展[10]，Bcl-2等的大量表達可以降低子宮內膜異位癥內膜間質細胞對凋亡刺激的敏感性，使其免于被腹腔中的巨噬細胞吞噬或者以其他方式降解[11]。最終凋亡異常導致異位子宮內膜細胞在腹腔中的存活能力增強，異位癥發生、發展加劇。NF-κB是介導多種細胞信號通路的關鍵因子之一，參與機體免疫應答、參與炎性反應、應激反應等。王芳等[12]研究發現，與正常子宮內膜組織比較，NF-кB在子宮內膜異位癥在位內膜表達有增強趨勢，而在異位內膜組織表達增強最顯著（P＜0.05）。對子宮內膜異位癥研究發現，患者腹腔液中巨噬細胞數量、炎癥細胞因子TNF-α、IL-1和IL-6等水平均明顯高于正常生化指標。NF-κB可通過調控炎癥信號通路中酶的基因轉錄誘導炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1等大量表達。另一方面，NF-κB可以通過阻斷線粒體釋放細胞色素C而具有抑制細胞凋亡的作用，研究發現Caspase3與Bcl-2存在相互制約的關系。因此，NF-κB對子宮內膜異位癥的發生、發展具有很重要的作用，極有可能成為潛在治療內異癥的靶點。

子宮內膜異位癥在育齡婦女中有約10%的發病率，嚴重影響了患者的健康及生活。地諾孕素于2011年在加拿大上市，用于治療婦女子宮內膜異位相關疾病。臨床研究發現，地諾孕素可以有效減輕患者內異癥引起的骨盆疼痛等癥狀，而且其耐受性好、不良反應少。地諾孕素對機體電解質平衡、糖代謝、腎上腺功能和甲狀腺功能無明顯影響，而且地諾孕素無肝損傷作用，其對凝血機制和血脂代謝的影響不能成為誘發心血管疾病的危險因素。頭痛、不規則出血和乳房不適是地諾孕素常見的不良反應，但是其會隨著治療而逐漸減輕。

總之，地諾孕素有明顯誘導異位內膜間質細胞凋亡的作用，它降低了異位內膜間質細胞對NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白的表達，這很可能是地諾孕素治療子宮內膜異位癥的潛在作用靶點及作用機制。

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