不同目標血糖膿毒癥大鼠肝、肺損傷的病理分析＊

何永來，齊 妍，張景玉，朱建波，單 琦，蔣金芳，梁偉華，李洪安，程青虹▲

（1.石河子大學醫學院第一附屬醫院ICU，新疆石河子832000；2.石河子大學醫學院病理系／第一附屬醫院病理科，新疆石河子832002；3.石河子大學醫學院預防醫學系，新疆石河子832000；4.河南科技大學第一附屬醫院新區ICU，河南洛陽471000）

膿毒癥是外科臨床常見的一種危重癥，除了可以引起劇烈的全身炎性反應外，還常導致肝、肺、腎、腸道和腦等多個器官的功能損傷，其中肺損傷發生早、病情重，常是患者死亡的直接原因，但是肝、肺損傷的發生機制目前尚不完全清楚[1-2]。膿毒癥患者應激狀態下，胰高血糖素、糖皮質激素等反向調節激素常分泌增加，而胰島素則分泌正常或減少，使機體分解代謝和糖異生作用增強而糖原合成作用減弱，造成血糖水平升高及自由脂肪酸、酮體和乳酸產生增多，導致細胞代謝功能的失調和炎癥因子級聯反應的啟動[3]，導致大量炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1、IL-6[4]等釋放入血，加之激活的粒細胞和單核巨噬細胞釋放大量的超氧化物，從而直接引起不同器官炎癥損傷。同時，大量炎癥因子的釋放可選擇性地激活轉錄因子、生長因子和次級調節因子，從而間接引起機體多種調節功能紊亂，進一步造成肝、肺等重要器官的損傷[5]。因此，加強對膿毒癥狀態下肝肺功能障礙的防治及血糖的維護具有重要的臨床意義。本研究以盲腸結扎穿孔術（CLP）造成的膿毒癥大鼠為模型及不同血糖控制組模型鼠，從而來評估及分析肝、肺損傷的病理形態改變，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取40只SPF級健康雄性成年SD大鼠，體質量（300±20）g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供。適應性飼養1周，溫度（22±3）℃，濕度（50±20）%，每天光照12h／黑暗12 h，提供約15g全營養鼠糧及足量飲水。將SD大鼠按隨機數字表法分為5組：假手術組（Sham組，n＝8）、膿毒癥組（CLP組，n＝8）、血糖控制 A組（A組，n＝8）、血糖控制B組（B組，n＝8）；血糖控制C組（C組，n＝8）。各組大鼠術前禁食12h，不禁水，用1%戊巴比妥鈉注射液（100mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥位固定，頸部和腹部備皮。各組大鼠取右頸部縱行切口1.5cm，無菌條件下分離并暴露右頸外靜脈，行右頸外靜脈置管術。置入直徑約1.0mm的一次性硬膜外麻醉導管，置入深度約3.0cm，此時導管前端在上腔靜脈內（經解剖證實），遠心端一道，近心端兩道結扎固定導管。建立由切口至頸背部的皮下隧道，導管由頸背部引出并穿行于彈簧內，彈簧一端固定于頸背部皮膚，另一端固定于飼養籠外的支架上。導管外端接三通管，用25U／mL肝素液0.2mL保留沖洗導管，封管備用。并通過微量注射泵靜脈給藥。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥大鼠模型的制備 采用改良的CLP法制備大鼠膿毒癥模型（模型成功標準：可達到動物SIRS參照標準[6]，且經病理學觀察可見膿毒性肝、肺損傷）。CLP模型鼠制備具體方法：中、下腹正中切口2.0cm，在盲腸根部用無菌4號線結扎，注意避開血管，自制穿孔針在距盲腸末端1.0cm處戳孔，直徑0.5cm，擠出約黃豆粒大小糞便，然后把盲腸推回腹腔，結扎離斷雙側網膜，關閉腹腔，逐層縫合。術后立即皮下注射50mL／kg乳酸鈉林格液，補充手術過程中的體液丟失。所有大鼠實驗期間禁食經靜脈給予營養支持，每日攝入總熱量均控制在70kcal／只左右，此為正常成年大鼠每日正常生理需要量。

1.2.2 各組處理方案及胰島素的配制 Sham組：僅做開關腹處理，靜脈泵注與其他各組等容量的生理鹽水；CLP組：行CLP，靜脈泵注與各血糖控制組等容量的生理鹽水；各血糖控制組（A、B、C組）：行CLP，靜脈泵注胰島素生理鹽水溶液，其中A組目標血糖控制在4.4～6.1mmol／L，B組目標血糖控制在6.1～8.3mmol／L，C 組 目標血 糖控制 在 8.3～10.0 mmol／L。胰島素用法為15U胰島素加入生理鹽水20mL內以微量泵泵入，運用快速血糖儀檢測大鼠尾靜脈血糖水平，及時調整胰島素用量，間隔為1h。各組間進液體量的差異用生理鹽水補齊。實驗所用的胰島素為速效胰島素注射液。

1.2.3 肝、肺組織光鏡標本的制備及組織病理評分 模型制備成功后，各組術后12h后取肝、肺組織，立即放入10%中性福爾馬林固定，6～12h后進行石蠟組織包埋，制備4μm切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，用中性樹膠封片。光鏡下觀察病理組織學變化，并參考 Aslami等[7]和 Hou等[8]的方法計算肝、肺組織損傷病理評分參考：肺損傷病理評分共7項指標，（1）肺泡壁毛細血管擴張、充血；（2）肺泡腔內水腫液；（3）肺間質水腫；（4）炎性細胞浸潤支氣管；（5）肺泡壁增厚變寬（炎性細胞浸潤或者纖維化）；（6）肺間質出血；（7）肺泡腔內見紅細胞，每項指標評分為無病變計0分，＜25%計1分，25%～＜50%計2分，50%～75%計3分，＞75%計4分，再計算5個400倍視野評分的平均值。肝損傷病理評估通過8項指標，（1）肝細胞水腫；（2）脂肪變性；（3）碎片狀壞死；（4）彌漫壞死或者橋接壞死；（5）肝竇擴張；（6）肝竇水腫；（7）匯管區纖維化；（8）匯管區淋巴細胞浸潤（超過50個細胞）。每項指標評分：無病變計0分，＜25%計1分，25%～＜50%計2分，50%～75%計3分，＞75%計4分，再計算5個400倍視野積分的平均值。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料以±s表示，整體比較方差齊時采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠肝、肺組織病理形態變化

2.1.1 各組肺損傷的病理形態改變 Sham組肺小葉組織形態無明顯異常，CLP組在肺小葉及支氣管壁均出現較重的化膿性炎癥改變，部分肺泡腔內及支氣管腔內出現膿液，間質大量中性粒細胞浸潤，血管高度擴張充血（圖1）。血糖控制組肺損傷的改變隨著血糖水平升高損傷逐漸加重：A組＜B組＜C組，主要表現為肺泡壁毛細血管充血、肺泡壁炎癥浸潤程度、肺間質水腫均呈逐漸加重趨勢。

圖1 血糖控制B組和C組及CLP組的肺損傷病理形態改變

圖2 血糖控制B組和C組及CLP組的肝損傷病理形態改變

表1 膿毒癥大鼠及各血糖控制組肺損傷病理評分結果（±s，分）

表1 膿毒癥大鼠及各血糖控制組肺損傷病理評分結果（±s，分）

＊：P＜0.05，與sham組比較；▲：P＜0.05，與A組比較。

總評分Sham 組 0.57±0.54 0 0.57±0.54 0.43±0.54▲ 0.14±0.38 0.57±0.54 0 2.43±0.98組別 肺泡壁淤血 肺泡腔水腫液 肺間質水腫 支氣管炎癥 肺泡壁增厚 肺間質出血 肺泡腔紅細胞▲CLP組 2.71±0.49＊▲ 1.86±0.38＊▲ 2.71±0.49＊▲ 2.86±0.38＊▲ 2.86±0.38＊▲ 2.71±0.49＊▲ 1.86±0.38＊▲ 18.43±2.23＊▲A組 1.00±0.54 0.38±0.74 1.00±0.54 1.63±0.74＊ 0.63±1.06 1.00±0.54 0.38±0.74 7.25±4.10＊B組 1.86±0.90＊▲ 1.57±0.79＊▲ 1.86±0.90＊▲ 1.71±0.49＊ 1.86±1.07＊▲ 1.86±0.90＊▲ 1.57±0.79＊▲ 12.57±2.34＊▲C組 1.75±0.46＊▲ 1.75±0.46＊▲ 1.75±0.46＊▲ 2.88±0.35＊▲ 2.38±0.52＊▲ 1.75±0.46＊▲ 1.75±0.46＊▲ 15.88±2.64＊▲

表2 膿毒癥大鼠及各血糖控制組肝損傷病理評分結果（±s，分）

表2 膿毒癥大鼠及各血糖控制組肝損傷病理評分結果（±s，分）

＊：P＜0.05，與Sham組比較；▲：P＜0.05，與A組比較。

組別 肝細胞水腫 肝脂肪變性 肝竇擴張 肝竇水腫 匯管區纖維化 匯管區炎癥 總評分Sham 組 0.57±0.54 0.57±0.54 0.14±0.54 0 0 0.43±0.54 1.43±0.79 CLP組 3.71±0.49＊▲ 3.71±0.49＊▲ 3.57±0.54＊▲ 3.14±0.38＊▲ 1.86±0.38＊▲ 2.43±0.54＊▲ 17.43±2.07＊▲A 組 0.75±0.46 0.75±0.46 0.63±0.74 0 0 0.50±0.54 2.25±1.67 B組 2.00±0.58＊▲ 2.00±0.58＊▲ 1.86±0.69＊▲ 1.00±0.58＊▲ 1.14±0.38＊▲ 1.43±0.54＊▲ 9.00±2.71＊▲C組 3.25±0.46＊▲ 3.25±0.46＊▲ 2.63±0.52＊▲ 1.75±0.46＊▲ 1.75±0.46＊▲ 1.75±0.46＊▲ 13.75±1.83＊▲

2.1.1 各組肝損傷的病理形態改變 Sham組肝小葉組織形態結構無明顯異常，CLP組肝細胞損傷明顯比其他組嚴重，肝細胞彌漫水樣變性，部分區碎片狀壞死，肝竇高度擴張、充血，匯管區可見炎性細胞浸潤明顯（圖2）。血糖控制組3組隨著血糖水平升高，其肝細胞水樣變性、脂肪變性、間質炎癥及間質充血均逐漸加重，依次為A組＜B組＜C組。

2.2 各組大鼠肝、肺組織損傷評價

2.2.1 肺損傷病理評分 根據Aslami等[7]肺損傷病理標準，總評分CLP組、血糖控制組與Sham組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），肺損傷程度呈逐漸加重趨勢；CLP組與血糖控制A組和B組差異有統計學意義（P＜0.05），與C組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；血糖控制3組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。其余各指標組間分析比較，除A組與對照組、B組與C組之間差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2.2 肝組織損傷病理評分 根據 Hou等[8]肝組織損傷病理評分標準，5組均沒有出現肝細胞彌漫壞死或者橋接壞死，且只在CLP組出現了碎片狀壞死，具體評分見表2。CLP組及血糖控制組與Sham組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；肝細胞水樣變性和脂肪變性這兩項指標，除CLP組與血糖控制C組間差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各組間差異均有統計學意義（P＜0.05）；對于匯管區炎癥這一指標，除血糖控制B組和C組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各組差異均有統計學意義（P＜0.05）。通過總評分，與Sham組比較，血糖控制A、B、C組及CLP組，肝損傷程度呈逐漸加重趨勢。

3 討 論

膿毒癥是臨床上一種常見但較難治療的全身炎癥反應綜合征（MODS），盡管現在醫療技術日漸進步，但其病死率仍然較高。國外流行病學調查結果顯示，全球每年新發重度膿毒癥患者超過1 800萬，發病率為0.3%，且以每年1.5%的速度遞增。美國每年新增病例70萬例，發病率每年增長1.5%～8.0%，其中死亡21萬例，病死率大于30%[9-10]。鑒于膿毒癥的危害性，2002年10月歐美國家多個組織共同發起并簽署“巴塞羅那宣言”，旨在降低膿毒癥病死率[11]，但目前膿毒癥病死率仍在25%以上。其本質是大量細胞因子和炎癥介質釋放導致的宿主自身免疫性損傷，在膿毒癥早期肺功能即可發生異常，并與病死率有密切關系，大約有40%～50%的患者合并肝臟、肺組織和心臟功能不全，其中約7%出現嚴重呼吸功能衰竭[1]。危重患者應激狀態下，胰高血糖素、糖皮質激素、兒茶酚胺、生長激素等反向調節激素常分泌增加，而胰島素則分泌正常或減少，使機體分解代謝和糖異生作用增強而糖原合成作用減弱，使血糖水平升高及自由脂肪酸、酮體和乳酸產生增多，導致細胞代謝功能的失調和炎癥因子級聯反應的啟動，使大量炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6等釋放入血，加之激活的粒細胞和單核巨噬細胞釋放大量的超氧化物，從而直接引起組織細胞的炎癥損傷和氧化損傷。另外，大量炎癥因子的釋放可選擇性地激活轉錄因子、生長因子和次級調節因子，間接引起機體多種調節功能紊亂，其中主要為抑制內皮型一氧化氮合酶和激活野生型一氧化氮合酶，導致體內一氧化氮釋放的調節紊亂，引起血管舒縮功能失調，導致肝、肺、腎、心臟等臟器的功能障礙。

膿毒癥所致的多器官功能衰竭是重癥監護室（ICU）患者常見的死亡原因，其中肺、心臟等功能障礙出現的較早且癥狀較為明顯。因此，支持治療通常集中肺、腎臟和心臟等。尤其是炎癥較重時，肺部損傷更為明顯。Song等[2]通過膿毒癥大鼠模型所致的急性肺炎，研究膿毒癥與炎癥的相關性，演示了中性粒細胞在肺炎中遷移至受損組織，導致肺小葉結構及肺泡損傷病理形態改變，這種損傷危機到大鼠免疫系統，甚至是會引起死亡，而血液純化則可能降低膿毒癥的病死率。本實驗也發現，CLP組所致的肺組織炎性反應最重，肺泡壁明顯增厚，肺間質、肺泡壁、支氣管壁，甚至肺泡腔內均可見多量中性粒細胞浸潤，部分支氣管腔內可見膿液。

臨床ICU患者出現肝功能障礙或者肝衰竭相對較晚或少見。然而，Bulger等[13]研究發現，在113例膿毒性休克患者中，肝功能的異常主要表現為黃疸，其發生率為23%。臨床上，在感染性休克患者中，肝功能明顯異常者少見；個別出現肝小葉壞死的患者可表現出短暫的（5～25d）、血清酶升高（正常上限10～300倍）。此種臨床現象曾被稱為“休克肝”。本研究CLP組的肝損傷以變質性炎為主，較對照組肝細胞彌漫水樣變性，部分區碎片狀壞死，肝竇高度擴張、充血，匯管區可見炎細胞浸潤明顯。

臨床觀察發現，危重患者不僅常出現血糖水平升高，而且還常伴發血脂代謝障礙，主要表現在血三酰甘油的升高和高密度脂蛋白及低密度脂蛋白的降低。而研究顯示，強化胰島素治療可以顯著改善血脂代謝異常，使危重患者的血三酰甘油降低、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白升高，從而有利于血清脂質的轉運和內毒素的清除、改善患者預后。血糖水平升高后可作用于內皮細胞，使其釋放組織纖溶酶原激活物抑制劑-1和激活von Willebrand因子，從而引起血漿纖維蛋白溶解減少和血小板高度激活，加之內皮細胞釋放內皮素和血栓素B2等內源性物質引起微循環血管強烈收縮，使組織細胞缺血壞死，引起彌散性血管內凝血（DIC），最終導致MODS的發生[5]。應激性高血糖除了致炎作用外，還存在免疫抑制作用，主要表現在以下3個方面：（1）高血糖可以導致白細胞的黏附、趨化、吞噬、細菌殺傷和呼吸爆發等功能受損；（2）高血糖可以導致外周血B淋巴細胞和T細胞的凋亡增加，使其數量明顯減少；（3）高血糖可以導致免疫球蛋白糖基化，使其免疫功能下降。另外，由于危重患者往往存在免疫功能失調，所以極易發生嚴重感染[5]。本研究結果顯示，隨著血糖水平升高，肝、肺組織損傷均逐漸加重，依次為A組＜B組＜C組。A組血糖在正常范圍內，其病變也最輕微，比Sham組的損傷稍重，但差異無統計學意義（P＞0.05），提示膿毒癥大鼠血糖維持在正常范圍內時，可減少或減慢病情的進展。血糖一旦持續升高，肝、肺組織病變即開始加重。有文獻表明，機體大部分組織細胞的葡萄糖攝取是直接依賴于細胞膜上的葡萄糖轉運體進行的，高血糖尤其是危重患者更容易出現細胞內糖超載，從而增強細胞的氧化應激，使氧自由基產生增多，導致組織細胞損傷；此外，細胞內糖超載還可以引起細胞的形態及功能異常，尤其是影響線粒體的形態及功能，線粒體功能失調引起組織細胞能量代謝紊亂，最終導致器官功能衰竭。

綜上所述，膿毒癥大鼠中血糖升高后明顯使得肝、肺組織病變加重，而將血糖維持在正常范圍內，肝、肺組織病變明顯減輕，這提示在臨床工作中，進行強化胰島素治療，也許可以降低膿毒癥患者的病死率和減低或者避免多器官功能障礙或衰竭。

[1] Martin GS，Mannino DM，Eaton S，et al.The epidemiology of sepsis in the United States from 1979through 2000[J].N Engl J Med，2003，348（16）：1546-1554.

[2] Song SO，Hogg J，Peng ZY，et al.Ensemble models of neutrophil trafficking in severe sepsis[J].PLoS Comput Biol，2012，8（3）：1-16.

[3] Calisto KL，Carvalho Bde M，Ropelle ER，et al.Atorvastatin improves survival in septic rats：effect on tissue inflammatory pathway and on insulin signaling[J].PLoS One，2010，5（12）：1-12.

[4] Mostafa Anower AK，Shim JA，Choi B，et al.Pretreatment with interleukin-6small interfering RNA can improve the survival rate of polymicrobial cecal ligation and puncture mice by down regulating interleukin-6production[J].Eur J Pharmacol，2012，688（1／3）：76-83.

[5] Hotchkiss RS，Tinsley KW，Swanson PE，et al.Endithelial cell apoptosis in sepsis[J].Crit Care Med，2002，30（5 Suppl）：S225-228.

[6] 盛志勇，胡森.多器官功能障礙綜合征[M].北京：科學出版社，1999：18-63.

[7] Aslami H，Pulskens WP，Kuipers MT，et al.Hydrogen sulfide donor naHS reduces organ injury in a rat model of pneumococcal pneumosepsis，associated with improved bio-energetic status[J].PLoS One，2013，8（5）：1-11.

[8] Hou LC，Qin MZ，Zheng LN，Lu Y，et al.Severity of sepsis is correlated with the elevation of serum high-mobility group box 1in rats[J].Chin Med J（Engl），2009，122（4）：449-454.

[9] Riedemann NC，Guo RF，Ward PA.The enigm a of sepsis[J].J Clin Invest，2003，112（4）：460-467.

[10] Martin GS，Mannino DM，Eaton S，et al.The epidemiology of sepsis in the United States from 1979through 2000[J].N Engl J Med，2003，348（16）：1546-1554.

[11] Dellinger RP，Levy MM，Rhodes A，et al.Surviving sepsis campaign：international guidelines for management of severe sepsis and septic shock：2012 [J].Crit Care Med，2012，41（2）：580-637.

[13] Bulger EM，May S，Kerby JD，et al.ROC investigators.Out-of-hospital hypertonic resuscitation after traumatic hypovolemic shock：a randomized，placebo controlled trial[J].Ann Surg，2011，253（3）：431-441.