過量氟引起成骨細胞內質網應激信號通路的基因差異表達＊

張亞樓，孫小娜，馮樹梅，李 甜，廖禮彬，白生賓，鐘近潔△

（1.新疆醫科大學基礎醫學院組織胚胎學教研室，烏魯木齊830011；2.新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心放射衛生科，烏魯木齊830001）

氟中毒是一種慢性全身性疾病，可致氟斑牙和氟骨癥。地方性氟中毒是我國流行最為廣泛、病情最為嚴重的重點地方病之一[1]。目前，氟中毒機制仍不清楚。研究表明染氟成骨細胞存在內質網應激[2-3]。但是對于內質網應激信號通路在染氟成骨細胞中的表達，未見報道。本研究用氟化鈉（NaF）干預體外培養的人成骨肉瘤細胞Saos-2，應用熒光定量PCR Array技術和蛋白免疫印跡法（Western blot）觀察對成骨細胞中未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）信號通路的差異基因蛋白表達，為揭示過量氟暴露下成骨細胞內質網應激的發生特點和開發相應的藥物保護劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 NaF，分析純（上海生工）；人成骨肉瘤細胞Saos-2購于上海細胞庫；AnnexinⅤ凋亡檢測試劑盒（Invitrogen）；MTS細胞增殖分析試劑盒（Promega）；RNeasy Plus Mini Kit；RT2First Strand Kit（Qiagen）；RT2SYBR Green qPCR Mastermix（Qiagen）；PCR 芯片（PAHS-089ZA-2）購于 Qiagen公司；實驗中所用一抗BIP、XBP1、ATF4、IRE1、CHOP、EIF2S1、β-actin均購自Abcam公司，羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）二抗、羊抗鼠HRP二抗購自武漢博士德。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 Saos-2在含10%胎牛血清的DMEM培養基于37℃、5%CO2培養箱進行貼壁培養，每2～3天根據細胞生長的密度和培養液酸堿度的變化更換培養液，當細胞匯合達度到80%進行傳代培養。

1.2.2 細胞增殖 Saos-2細胞生長處于對數生長期時，胰酶消化成單細胞懸液。細胞計數后以2×104細胞接種于96孔板，37℃、5%CO2培養。NaF用培養液配制，濃度分別為5、10、20、40、80mg／L，同時設立空白對照（對照組）。染氟時間為24h。每孔100μL培養基加入20μL MTS，酶標儀檢測吸光度值，檢測波長490nm。每種處理劑量設置5個復孔。

1.2.3 凋亡細胞的流式細胞儀檢測 將Saos-2細胞接種于25cm2的培養瓶中，待細胞長至鏡下細胞融合度為80%時，加入 NaF（0、5、10、20、40、80mg／L）作用24h后，再加入0.25%胰酶消化細胞，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個／mL，用AnnexinⅤ和PI雙染色在流式細胞儀上進行早期細胞凋亡的檢測。

1.2.4 PCR芯片檢測 將NaF（0、10mg／L）干預Saos-2細胞24h后，提取RNA。NANODROP分光光度計測定其濃度，瓊脂糖凝膠電泳測定其RNA完整性。取400ng RNA前轉錄合成cDNA，采用Qiagen公司RT2Profiler PCR Array進行熒光定量檢測，將cDNA模板適當稀釋后加入到實時熒光定量PCR（RT-PCR）反應混合液中，然后在含有基因特異性引物的96孔板各孔中加入等量反應液，于RT-PCR儀（Eppendorf Mastercycler ep realplex 2）上進行RT-PCR反應。計算每張PCR芯片中的每個基因的Ct值。每種處理組，重復用PCR芯片測定3次。采用ΔΔCt方法比較相應基因的表達量變化。表達量差異在2倍以上者為差異有意義基因。

1.2.5 蛋白表達檢測 采用Western blot法。提取各組細胞總蛋白，蛋白質定量試劑盒（BCA）法測定蛋白濃度。取30μg蛋白質，與5×上樣緩沖液混合，100℃變性10min。各種一抗以1∶1 000稀釋。加入ECL化學發光試劑，反應5min，X線片曝光后，顯影，定影，以管家基因β-actin作為內參照。

1.3 統計學處理 采用SPSS12.0統計軟件分析數據，細胞增殖及凋亡結果采用單因素方差（組間比較采用LSD法）分析，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞增殖結果 NaF（劑量分別為5、10、20、40、80mg／L）對人成骨細胞Saos-2作用24h后，細胞存活率分別為（100.678 5±2.830 3）%、（105.393 4±2.538 4）%、（106.125 7±2.048 4）%、（77.977 3±2.544 2）%、（30.237 7±0.632 7）%。與對照組比較，40、80mg／L組的細胞存活率差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 流式細胞儀檢測凋亡結果 NaF可以促進Saos-2細胞凋亡，在5、10、20、40、80mg／L濃度下Saos-2細胞凋亡率分別為4.8%、13.8%、37.0%、58.9%、63.2%（P＜0.05），呈現出劑量依賴性，其濃度越高，促凋亡作用越強，見圖2。

2.3 PCR芯片檢測結果 PCR芯片檢測顯示在總共84個檢測基因中表達下調的有FBXO6基因，表達上調的有BIP、XBP1、ATF4、PERK、IRE1α、IRE1β、ERO1LB、JNK3、PDIA3、USP14、HSPA1L、HSPH1、HTRA4、UGCGL1等14個基因，圖3。

圖1 不同濃度NaF對人成骨肉瘤細胞Saos-2的增殖抑制作用

圖2 不同濃度NaF對人成骨肉瘤細胞Saos-2的凋亡作用

2.3 Western blot檢測結果 0、5、10、20、40、80mg／L NaF作用Saos-2細胞24h后抽提細胞總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），分別行 EIF2Sα、ATF4、IRE1、GRP78、XBP1和CHOP蛋白檢測結果。BIP表達隨NaF劑量增高而增強；CHOP在40與80mg／L時表達，且逐漸增強；XBP1在5～10mg／L時，表達隨NaF劑量逐漸增強，在40與80mg／L時表達減弱；ATF4表達明顯隨NaF劑量增高而增強；IRE1也隨NaF干預劑量增高而表達增強，但不如ATF4明顯；EIF2a表達在各劑量組中基本保持不變，見圖4。

圖4 不同濃度NaF作用于人成骨細胞24h的蛋白表達

3 討 論

當細胞內未折疊蛋白質或錯誤折疊的蛋白質聚集在內質網內，即可引發內質網應激，從而進一步產生內質網應激反應，表現為UPR，以恢復或維持內質網的功能[4-5]。持續的內質網應激，如不能恢復，會導致細胞凋亡[6-7]。氟可以造成成骨細胞的內質網應激并引起UPR，并調節成骨細胞的分化和成熟[8]。引起內質網應激的途徑可能是氟離子引起的過氧化反應、內質網鈣代謝紊亂或者氟離子的直接化學作用[9-11]。

RT-PCR Array是目前較為簡單實用的檢測基因表達的方法，能夠一次性檢測84個與UPR相關的基因在mRNA水平上的表達，結果無需再進行實時熒光定量檢測。在本研究中，下調的基因FBXO6，與誘導內質網相關性降解（ER-associated degradation，ERAD）有關。在表達上調的14個基因中，屬于未折疊蛋白結合的基因有：UGCGL1、ERO1LB；屬于內質網蛋白質折疊的質量控制的基因有：GANC；屬于翻譯調節的基因有：EIF2A；屬于ERAD的基因有：HTRA4；屬于泛素化有關的基因為USP14；屬于轉錄因子的有：ATF4、XBP1、IRE1α、IRE1β；屬于凋亡相關基因的有：JNK3、PERK；屬于熱休克蛋白的基因有：HSPA1L、HSPH1、BIP；屬于蛋白質二硫鍵異構酶的基因有：PDIA3。

從芯片檢測結果，發現過量氟引起了成骨肉瘤細胞Saos-2未折疊蛋白信號通路中多種基因有意義表達，進一步用Western blot發現BIP、CHOP、XBP1、ATF4等蛋白表達隨劑量逐漸增高，ATF4、XBP1分別屬于內質網應激3條通路中的兩條：PERK和IRE-1，說明這兩條通路均參與了氟對成骨細胞的作用。本研究中尚未發現第3條通路ATF6路徑在染氟過程中的變化。尤其是PTEN途徑，ATF4的蛋白表達呈現出典型的劑量反應關系。XBP1在NaF 5～20mg／L表達逐漸增強，與此時成骨細胞內質網應激狀態增強有關。而在內質網應激較強狀態時，40、80mg／L的表達減少，XBP1s蛋白表達受到抑制，可能是UPR受阻，進入誘導細胞凋亡[12]。而此時染氟成骨已經不能處理UPR，成骨細胞逐漸轉向凋亡，這與流式細胞儀反映出的結果相符。CHOP的表達與凋亡密切相關，在芯片的檢測結果中雖然沒有發現其高表達，但是據已有的研究和本次實驗發現，在NaF 20、40mg／L時表達明顯增高，也與流式細胞儀的凋亡百分率結果相符合。

綜上所述，氟所激活的UPR信號通路與成骨細胞的生長和增殖密切相關。尤其是氟中毒條件下成骨細胞內質網應激與細胞凋亡存在一定的關系，本研究僅涉及少數凋亡相關基因，與凋亡信號通路尚未聯合研究，并且其發生的先后順序仍需要進一步研究。

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