動態灌注與靜態保存對犬離體肺組織中AQP1表達的影響＊

孫相華，洪文娟，洪志鵬△，祝艷翠，周 菊，王亞麗

（昆明醫科大學第一附屬醫院：1.干部醫療科；2.胸外科；3.ICU；4.感染疾病科，昆明650032）

肺移植是治療晚期肺實質及肺血管疾病的惟一有效方法，隨著外科技術、術后處理、免疫抑制劑的快速發展，肺移植患者存活率有了明顯提高[1]。然而仍有15%～20%的肺移植患者在術后早期出現嚴重的移植肺功能障礙，其主要原因為離體肺保存方式欠佳以及缺血再灌注損傷[2-3]。供肺保存的質量對肺移植的成功與否起著決定作用，不同的保存方式對離體肺組織的結構和功能有著重要的影響。單存肺動脈灌洗后低溫保存法是目前應用最廣泛的保存方式，該保存方式簡單、易操作，但不符合肺循環的生理條件，易導致肺循環栓塞，影響供肺的保存質量和保存時間。隨著肺移植技術的發展，對供肺保存的質量和時間要求也越來越高。本研究通過比較體外循環機持續灌注、間斷壓力灌注、單存低溫保存離體肺的水通道蛋白1（AQP1）表達變化，探討離體肺的損傷機制，闡明模擬肺循環和心臟機械灌注的優越性，為保證安全、有效、較長時間的離體肺保存創造了有利條件。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康成年Mongrel犬30只，犬齡2～3年，雌雄不限，體質量15～18kg（購自昆明醫科大學動物實驗中心）。實驗前禁食12h，禁飲6h。分成3組：體外循環機動態灌注組（體外循環組）、間斷壓力灌注組（壓力灌注組）和靜態的單存肺動脈灌注后低溫保存組（低溫保存組），每組10只。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 手術相關器械、PHILIPS有創動脈壓監測儀、TKR-200C小型動物呼吸機、體外循環機、離體肺保存液、AQP1抗體等。

1.2.2 肺組織標本摘取 3%戊巴比妥鈉犬前肢靜脈注射，出現睫毛反射消失，肌力下降時立即進行四肢固定、氣管插管、脫毛處理（取仰臥位，前胸脫毛）；游離股動、靜脈并插管，正中開胸，心包內游離上、下腔靜脈和主動脈，全身肝素化（500IU／kg），肺動脈接有創動脈監測儀，監測及記錄實時肺動脈壓，升主動脈插心臟麻痹液灌注管，肺動脈干插入肺灌洗導管，依次阻斷上、下腔靜脈和升主動脈。灌洗心臟麻痹液，切斷下腔靜脈，排出心臟麻痹液。心臟停跳后，開始肺灌洗，切除左心耳尖端，排出灌洗液，收集保存。在保持正常機械通氣的條件下，完整摘取雙肺。心臟停搏前同時從股動脈回收血液，采血瓶預存。摘取雙肺后稱取濕肺質量，經氣管向肺內按潮氣量10 mL·kg-1·min-1進行通氣，維持呼吸，FiO221%，進行持續體外循環機灌注、間斷壓力灌注、單存灌注離體肺循環后低溫浸泡保存直至實驗結束。

肺保存液成分：Na＋138.0mmol／L，K＋6.0mmol／L，Cl-142.0mmol／L，Mg2＋0.8mmol／L，SO22-0.8mmol／L，PO43-0.8mmol／L，Ca2＋0.3mmol／L，HCO3-1.0mmol／L，右旋糖酐40.0g／L，葡萄糖0.9g／L。

離體肺組織標本留取方法：離體肺保存0、60、120、180、240、300、360、420、480min 取 材；組 織 標 本 約 1.5cm×1.0cm×0.5cm備用，每次取材后縫合創面，防止漏氣。

1.2.3 HE染色法觀察犬離體肺組織形態學改變 肺組織采用10%甲醛溶液固定，95%乙醇常規濃度梯度脫水，二甲苯透明2次，石蠟包埋，常規制備5μm切片，HE染色。

1.2.4 免疫組織化學法檢測犬離體肺組織AQP1的表達石蠟切片脫蠟和水化后，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）沖洗3次，對組織抗原進行相應的修復。每張切片加1滴3%過氧化氫，室溫下孵育，PBS沖洗，加一抗，室溫下孵育60min，PBS沖洗，加二抗，室溫下孵育10min，PBS沖洗加新鮮配制的二氨基聯苯胺（DAB）溶液，顯微鏡下觀察3～5min，自來水沖洗，蘇木素復染，分化，自來水沖洗，PBS返藍，切片經梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封固。結果半定量的判定方法：在每個時間點抽取染色清楚的切片，每張切片于光鏡下（×400）隨機抽取5個視野，固定窗口面積，計數AQP1，根據AQP1著色深度及陽性細胞數分別記分為0～3分，著色深度以多數AQP1呈色程度為準。如果肺泡周圍出現明顯黃色或棕黃色及棕褐色顆粒為陽性染色，不著色的為0分，呈黃色時為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。整塊切片中陽性染色占所有細胞中的比例小于或者等于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，大于75%為4分。根據上述兩項指標的積分相乘進行半定量分析。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測犬離體肺組織AQP1的表達 組織蛋白抽提，配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠，4%濃縮膠，取蛋白質樣品上樣電泳，采用硝酸纖維素膜濕轉，AQP1多克隆抗體和羊抗鼠IgG二抗稀釋比例分別為1∶500與1∶2 000，將ECL顯色試劑滴加到膜上，曝光顯影保存。采用相關分析軟件分析，以每條蛋白電泳帶與β-actin的灰度值比值表示AQP1蛋白的相對表達量。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 犬離體肺組織病理改變 通過觀察病理HE染色切片，發現體外循環組肺泡組織結構比壓力灌注組及低溫保存組完整，炎性細胞及滲出液少，肺泡間隔也小。組內對比可見，隨著離體時間的延長，肺泡組織結構逐漸塌陷，炎性細胞及滲出物增多，肺泡間隔也逐漸增寬，肺泡腔內可見滲出物。綜合比較，在同一時間點，體外循環組的組織結構損傷變化比壓力灌注組和低溫保存組輕。

2.2 免疫組織化學法檢測結果 隨著時間推移，各實驗組AQP1的表達量呈現下降趨勢；在每個時間點上，體外循環組AQP1的表達量高于壓力灌注組，壓力灌注組又高于低溫保存組。體外循環組3～8h各時間點兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；在1～2h各時間點，各組間兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；在3～8h各時間點，各組間兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；低溫保存組3～8h各時間點兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；壓力灌注組3～8h各時間點兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；見圖1～3，表1。

表1 免疫組織化學檢測離體犬肺組織AQP1的表達結果（±s）

表1 免疫組織化學檢測離體犬肺組織AQP1的表達結果（±s）

0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h體外循環組 10.40±0.63 10.00±0.73 9.70±0.66 8.20±0.99 7.60±1.57 6.60±1.17 5.70±1.49 4.70±0.95 3.80組別±0.82壓力灌注組 10.40±0.63 10.10±0.74 9.80±0.82 7.50±1.47 6.50±1.26 5.40±1.51 4.30±1.31 3.10±0.74 2.10±0.71低溫保存組 10.40±0.63 10.10±1.03 9.60±0.67 7.00±1.24 5.70±1.72 4.10±0.99 3.40±0.84 2.40±0.70 1.20±0.42

表2 Western blot檢測離體犬肺組織AQP1的表達結果（±s）

表2 Western blot檢測離體犬肺組織AQP1的表達結果（±s）

0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h低溫保存組 1.11±0.06 1.07±0.04 1.06±0.03 1.06±0.04 0.95±0.05 0.87±0.05 0.80±0.09 0.72±0.05 0.63±0組別.04壓力灌注組 1.11±0.06 1.16±0.04 1.10±0.05 1.08±0.04 1.02±0.05 0.93±0.04 0.90±0.05 0.84±0.07 0.73±0.06體外循環組 1.11±0.06 1.12±0.07 1.11±0.05 1.10±0.05 1.06±0.04 0.99±0.05 0.94±0.04 0.89±0.04 0.86±0.07

圖1 低溫保存組離體犬肺組織AQP1免疫組織化學染色（×400）

圖2 壓力灌注組離體犬肺組織AQP1免疫組織化學染色（×400）

圖3 體外循環組離體犬肺組織AQP1免疫組織化學染色（×400）

圖4 各組不同時間點離體肺組織AQP1的表達結果

圖5 各時間點下各組離體肺組織AQP1的表達結果

2.3 Western blot檢測結果 各種保存方式下，隨著保存時間的延長，條帶灰度變淺，提示AQP1在離體肺組織中的表達隨著時間的延長呈逐漸減少的趨勢（圖4）。各時間點下，0～3 h的各條帶灰度基本均勻一致，但在4～8h條帶灰度逐漸變淺（圖5）。各實驗組內0～3h兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；低溫保存組內4～8h在組內各時間點（除5h與6 h外）兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；壓力灌注組4～8h在組內各時間點（除3h與4h、5h與6h外）兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；體外循環組4～8h在組內各時間點兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；在1～3h各時間點，各組間兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；在4～8h各時間點，各組間兩兩比較（除4h和6h壓力灌注組與體外循環組外），差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

3 討 論

目前國際公認的離體肺保存時間最好在4h以內，超過4 h，發生移植肺功能障礙的概率明顯增加[4]。最常用的保存方式為肺循環灌注后的單存低溫保存，既往研究表明，離體肺保存過程中最容易出現細胞損傷，它是一個非常復雜的過程，主要包括炎性細胞因子的產生[5]、氧自由基的釋放[6]、微小血管的損傷及其通透性的增加[7]。

水的跨膜轉運對維持細胞正常代謝具重要作用。水通道蛋白是一組介導水的跨膜轉運的通道蛋白，在肺內，其位于肺泡毛細血管內皮的血液側，主要負責轉運肺間質內的水分[8]。AQP1不僅對各級支氣管及肺組織內生理和病理狀態下水的吸收和轉運有重要調節作用，同時也協同鈉通道和Na＋-K＋-ATP酶對胸腔內液體進行轉運。在肺泡上皮細胞、氣管支氣管纖毛細胞質膜的頂端及漿液細胞、黏液細胞的基側部存在的AQP1可能與肺水腫消除有關[9]。有研究表明，敲除AQP1后肺泡毛細血管水的通透性呈顯著下降趨勢，表明其具有轉運或協同水轉運的能力[10-11]。

本研究中，通過比較體外循環機持續灌注、間斷壓力灌注、單存低溫保存這3種離體肺保存方式下，肺組織AQP1表達的變化來研究離體肺保存的最佳方法。本研究結果表明，在每種保存方式下，AQP1在離體肺組織中的表達隨著時間的延長呈逐漸降低的趨勢，說明隨著離體肺保存時間的延長，缺血缺氧等各種因素的影響，導致肺組織水腫越來越重。脫離機體后，肺組織仍然進行著有氧代謝，雖然低溫可以有效限制有氧代謝的進程，但隨著時間的延長，離體肺的缺血性損傷不可避免，主要表現在肺泡間質水腫，肺泡間隔增寬，影響了離體肺保存的質量，加重了肺移植后再灌注損傷[12]。既往研究證實，隨缺血缺氧時間延長，肺血管內皮細胞結構損傷越重，血管的通透性增大，合成和釋放多種細胞生長因子，導致水分及細胞毒性成分進入肺泡間質，使得呼吸膜厚度增加，水通透性明顯降低[13]。

同時在3種保存方式間比較研究發現，體外循環灌注組離體肺組織中AQP1的表達明顯高于壓力灌注組，壓力灌注組又高于低溫保存組，表明體外循環機械灌注對離體肺的保護作用明顯優于間斷壓力灌注和單存低溫保存。體外循環灌注肺動脈恢復了肺循環，使保存液在肺內更加均勻分布，能更好地清除微小血管內紅細胞和血栓，并且可有效除去氧自由基、激活的炎性介質和補體等細胞毒性成分，改善細胞有氧代謝，減輕肺表面活性物質的損傷，保護上皮細胞的功能，減輕離體肺缺血性損傷。體外循環灌注克服了肺微循環栓塞、肺冷卻不均勻、灌洗液分布不均勻、灌注壓不易控制、灌洗溫度難以調節、灌注量或多或少、容易受到人主觀因素的影響等低溫保存不能解決的困難。

綜上所述，本研究中離體肺在通氣過程中以體外循環機械灌注肺循環，模擬了肺循環和心臟灌注的特點，確保恒溫、灌注標準化、灌注充分均勻，更接近于肺循環的生理狀態，從而有效地延長了肺保存的時限，為安全、有效、較長時間的離體肺保存創造了有利條件，為肺移植提供更好的肺源，也為肺保存方法提供了更好的研究方向。

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