miR-26a在結腸癌組織中的表達及其臨床意義

賀利恒，李 燕，黃小都，黃 俊，曾 希*

(1.南華大學 腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001；2.耒陽市人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖南 耒陽 421800；3.婁底市中心醫(yī)院，湖南 婁底 417000)

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miR-26a在結腸癌組織中的表達及其臨床意義

賀利恒1,2，李 燕1,3，黃小都2，黃 俊1，曾 希1*

(1.南華大學 腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001；2.耒陽市人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖南 耒陽 421800；3.婁底市中心醫(yī)院，湖南 婁底 417000)

目的：探討miR-26a(Homo sapiens miR-26a)在人結腸癌組織中的表達改變情況及其臨床意義。方法：運用qRT-PCR檢測72例患者結腸癌組織及對應癌旁正常組織中miR-26a的表達情況。結果：qRT-PCR結果顯示，miR-26a在結腸癌組織中較癌旁組織表達顯著下調(diào)，miR-26a的表達隨著結腸癌臨床分期的演進和浸潤的加深而下調(diào)，且有淋巴結轉(zhuǎn)移組織的miR-26a表達顯著低于無淋巴結轉(zhuǎn)移組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：miR-26a在結腸癌組織中下調(diào)，且其下調(diào)程度與結腸癌臨床分期、浸潤深度以及淋巴結轉(zhuǎn)移相關。

miR-26a；結腸癌；臨床診斷

最新研究表明，miR-26a在乳腺癌組織和細胞中表達顯著下調(diào)。miR-26a模擬物轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞實驗發(fā)現(xiàn)，miR-26a可明顯抑制乳腺癌細胞增殖[1]。但是目前關于miR-26a在結腸癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色沒有任何報道。本研究采用qRT-PCR技術，首次分析miR-26a在人結腸癌組織中的表達改變情況及其臨床意義，為結腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供實驗依據(jù)，為其防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

組織標本來源于2010-2013年中南大學湘雅醫(yī)院及南華大學附屬第一醫(yī)院收治的結腸癌患者，均按照WHO結腸癌組織學分類及分級標準，其中58例為本研究所以前留下來的標本。miProfileTM miRNA qPCR試劑盒(廣州復能基因有限公司)；Real-time PCR 96孔板及封口膜(美國ABI 公司)。

1.2 miR-26a表達水平檢測

RT反應：反應體系為20μL，包括5×RT緩沖液4μL、25mmol/L鎂離子3μL、10mmol/L三磷酸脫氧核苷0.75μL、40U/μL RNA酶抑制劑0.25μL、1μmol/L miR-200c特異性RT引物1.2μL、200U/μL莫羅尼鼠白血病病毒RT酶0.2μL、RNA 1μg，無酶水加至20μL。反應條件：16℃下30min，42℃下30min，再在85℃下10min滅活RT酶，產(chǎn)物于-20 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

qRT-PCR反應：反應體系為20μL，包括稀釋后的RT產(chǎn)物2μL、2×qRT-PCR緩沖液10μL、5μmol/L miR-200c特異性PCR引物0.4μL、5 U/μL耐熱DNA聚合酶0.2μL、滅菌雙蒸水7.4μL。反應條件：先于95℃下活化Tag酶3min，然后于95℃下12s、62℃下35s，共40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 結腸癌組織中miR-26a表達水平

本研究運用廣州復能基因有限公司推出的miProfile miRNA qPCR Primer，以cDNA為模板的qPCR進行實驗驗證，檢測72例結腸癌患者的腫瘤組織及相應癌旁正常組織中的miR-26a表達水平。結果顯示，72例結腸癌組織中miR-26a表達水平是相應癌旁正常組織的0.625倍。筆者選取1例癌旁正常組織的miR-26a值為1，然后分析得到72例結腸癌組織中miR-26a的平均表達水平(2-△△CT)為(0.675±0.046)，癌旁正常組織中miR-26a的平均表達水平(2-△△CT)為(1.080±0.043)，二者比較差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.2 miR-26a的表達與結腸癌臨床病理參數(shù)之間的關系

以miR-26a表達值的中位數(shù)為臨界值，miR-26a表達值大于等于中位數(shù)為高表達，少于中位數(shù)為低表達。結果顯示，在72例結腸癌組織中有45例低表達，27例高表達。采用軟件分析發(fā)現(xiàn)，結腸癌組織中miR-26a的表達與患者年齡、性別、大體分型、分化程度等無顯著相關性，差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)；然而miR-26a的表達隨著結腸癌臨床分期的升高而下調(diào)(P=0.006)，腫瘤浸潤超過漿膜的結腸癌組織中miR-26a降低更明顯(P=0.045)；同時在有淋巴結轉(zhuǎn)移的結腸癌組織中miR-26a的表達顯著低于無淋巴結轉(zhuǎn)移組織 (P=0.020)，差異均具有統(tǒng)計學意義。

3 討論

miR-26a存在于兩個染色體位點上，miR-26a-1位于3號染色體CTDSPL基因內(nèi)含子，miR-26a-2位于12號染色體CTDSP2內(nèi)含子。目前有關miR-26a在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究報道很少，發(fā)表在國際頂級醫(yī)學雜志《New England Journal of Medicine》上的一篇報道顯示[2]，miR-26a在肝癌中表達下調(diào)，且在非癌肝組織中，女性的表達水平顯著高于男性。此外，miR-26a的表達水平與肝癌患者的生存時間及其對干擾素治療的敏感性相關。Lu等[3]報道，miR-26a在鼻咽癌中表達下調(diào)，其能通過靶基因EZH2抑制鼻咽癌細胞生長和致瘤性，以上研究均表明miR-26a是一個抑瘤miRNA。

本研究通過qRT-PCR證實miR-26a在結腸癌組織中表達顯著下調(diào)，其表達隨著結腸癌臨床分期的演進和浸潤深度的加深而下調(diào)，且有淋巴結轉(zhuǎn)移組織的miR-26a表達顯著低于無淋巴結轉(zhuǎn)移組織，提示miR-26a的下調(diào)可能與結腸癌的臨床分期、浸潤深度以及淋巴結轉(zhuǎn)移相關，這意味著miR-26a有希望成為早期大腸癌患者預后的標志物。目前已有許多miRNA被當作潛在的預后標志物，miR-320和miR-498表達下降均與TNM分期II型結直腸癌患者預后相關[4]。其他研究表明[5-6]，高水平表達的miR-200c、miR-185、miR-215以及低水平表達的miR-133b均與腫瘤預后不良相關。筆者將繼續(xù)深入研究miR-26a在結腸癌發(fā)病中的功能，系統(tǒng)闡明miR-26a參與結腸癌發(fā)生發(fā)展可能的分子機制，為其防治提供理論依據(jù)和實驗基礎。

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(責任編輯：尹晨茹)

2013-12-24

國家自然科學基金(81101643)

賀利恒(1980-)，湖南省耒陽市人民醫(yī)院主治醫(yī)師，研究方向為胃癌發(fā)病分子機制。

曾希，南華大學腫瘤研究所副教授，碩士生導師，南華大學病理教研室主任，研究方向為胃癌發(fā)病分子機制。

R735.3+5

A

1673-2197(2014)09-0006-02