清熱解毒口服液中山銀花的檢查方法研究

劉青芝，林永強(qiáng)，林 曉，郭東曉

（1.山東省醫(yī)藥工業(yè)設(shè)計(jì)院，山東濟(jì)南250013；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

清熱解毒口服液中山銀花的檢查方法研究

劉青芝1，林永強(qiáng)2，林 曉2，郭東曉2

（1.山東省醫(yī)藥工業(yè)設(shè)計(jì)院，山東濟(jì)南250013；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

目的建立薄層色譜法和高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC－ELSD），對(duì)清熱解毒口服液進(jìn)行山銀花檢查。方法清熱解毒口服液樣品以D101大孔吸附樹(shù)脂處理，富集山銀花的特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙。以該成分為山銀花的檢出指標(biāo)，采用TLC法進(jìn)行樣品的初篩，并以HPLC－ELSD法進(jìn)行限量檢查。結(jié)果兩個(gè)廠家提供的樣品中檢出山銀花。結(jié)論建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于判斷清熱解毒口服液中金銀花的投料情況。

清熱解毒口服液；金銀花；山銀花；灰氈毛忍冬皂苷乙

《中國(guó)藥典》1963年版首次收載金銀花，植物來(lái)源只有1種：忍冬科植物忍冬?！吨袊?guó)藥典》1977年版其來(lái)源增加了3種：紅腺忍冬、山銀花和毛花柱忍冬。金銀花的4種來(lái)源在此后的1985、1990、1995、2000年版藥典中均未作改變，直至《中國(guó)藥典》2005年版將金銀花分列為金銀花和山銀花，金銀花的來(lái)源修改為與1963年版相同；山銀花的來(lái)源為灰氈毛忍冬、紅腺忍冬和華南忍冬?！吨袊?guó)藥典》2010年版山銀花藥材項(xiàng)下增加了黃褐毛忍冬［1～4］。

由于各版《中國(guó)藥典》中金銀花藥材來(lái)源的改變，金銀花和山銀花在中藥制劑中的應(yīng)用比較混亂，但常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目不能將二者區(qū)分開(kāi)?；覛置潭碥找遥ɑ乙遥┖痛ɡm(xù)斷皂苷乙（川乙）為山銀花的專屬成分，現(xiàn)有文獻(xiàn)多以這兩種三萜皂苷作為指標(biāo)，建立山銀花的檢查方法［5，6］。對(duì)于藥材和處方簡(jiǎn)單的制劑，由于干擾成分少，結(jié)果易于判斷；而處方復(fù)雜的制劑中，可能含有影響結(jié)果判斷的成分。參考相關(guān)文獻(xiàn)［1，7，8］，我們選擇處方比較復(fù)雜的清熱解毒口服液（由石膏、金銀花、玄參、地黃等十二味中藥組成），以D101大孔吸附樹(shù)脂富集三萜皂苷并除雜，建立了該制劑中山銀花的TLC和HPLC檢查方法，并對(duì)4個(gè)生產(chǎn)廠家的4批樣品進(jìn)行了檢測(cè)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀（ELSD檢測(cè)器）；Sartorius CP225D電子天平。Merck硅膠G薄層層析板。

1.2 試藥 對(duì)照藥材來(lái)源：金銀花，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：121060－201107；山銀花，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121595－201202。對(duì)照品來(lái)源：灰氈毛忍冬皂苷乙，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：111814－201303，含量以92.8%計(jì)；川續(xù)斷皂苷乙，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：111813－201202，含量以93.4%計(jì)。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。收集的4批樣品：企業(yè)A，批號(hào)：130601，規(guī)格：200 mL／支（無(wú)蔗糖）；企業(yè)B，批號(hào)：120701，規(guī)格：20 mL／支（無(wú)蔗糖）；企業(yè)C，批號(hào)：13062727，規(guī)格：10 mL／支；企業(yè)D，批號(hào)：13070005，規(guī)格：10 mL／支。

2 TLC方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 硅膠G薄層板，以三氯甲烷－甲醇－水（6∶4∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

2.2 對(duì)照品溶液 分別取灰乙和川乙對(duì)照品約1 mg，各加甲醇1 mL使溶解，搖勻，得到灰乙和川乙對(duì)照品溶液。

2.3 對(duì)照藥材溶液 分別取金銀花和山銀花對(duì)照藥材0.5 g，各加甲醇10 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為金銀花和山銀花對(duì)照藥材溶液。

2.4 供試品溶液 取本品20 mL，加在D101型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑為2.0 cm，柱高為20 cm），用水200 mL洗脫，棄去水液，再用甲醇200 mL洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至干（溫度低于60℃），殘?jiān)?0%甲醇5 mL使溶解，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5 陰性對(duì)照溶液 取處方中所有藥味，按處方比例制成缺山銀花的陰性對(duì)照樣品。取陰性對(duì)照樣品20 mL，按“2.4”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.6 陽(yáng)性對(duì)照溶液 取山銀花替代金銀花，以及處方中其他藥味，按處方比例制成山銀花陽(yáng)性對(duì)照樣品。取陽(yáng)性對(duì)照樣品20 mL，按“2.4”項(xiàng)下方法制成陽(yáng)性對(duì)照溶液。

2.7 方法學(xué)考察和樣品測(cè)定 取收集到的4個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法分別制成供試品溶液。取供試品溶液，以及“2.2～2.6”項(xiàng)下灰乙對(duì)照品溶液、川乙對(duì)照品溶液、金銀花對(duì)照藥材溶液、山銀花對(duì)照藥材溶液、缺山銀花陰性對(duì)照溶液和山銀花陽(yáng)性對(duì)照溶液各2μL，按“2.1”項(xiàng)下條件，進(jìn)行TLC試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 TLC方法學(xué)考察和樣品測(cè)定薄層色譜圖

2.8 檢驗(yàn)依據(jù)的選擇 根據(jù)TLC結(jié)果（見(jiàn)圖1），缺山銀花陰性對(duì)照和金銀花對(duì)照藥材在灰乙對(duì)照品相應(yīng)位置無(wú)斑點(diǎn)，山銀花陽(yáng)性對(duì)照和山銀花對(duì)照藥材在相應(yīng)位置斑點(diǎn)明顯，因而灰乙可以作為山銀花的檢出依據(jù)；缺山銀花陰性對(duì)照在川乙對(duì)照品相應(yīng)位置有干擾，且供試品溶液在相應(yīng)位置斑點(diǎn)較多，干擾結(jié)果的判斷，故不采用川乙作為山銀花的檢出依據(jù)。4批樣品的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果

3 HPLC方法與結(jié)果

3.1 色譜條件 依利特Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～12 min，20%A→28% A；12～27 min，28%A→33%A；27～30 min，33%A；30～33 min，33%A→20%A；33～40 min，20%A）；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。理論板數(shù)按灰乙峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

3.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取灰乙對(duì)照品18.19 mg，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為灰乙對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取川乙對(duì)照品22.86 mg，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為川乙對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述兩種對(duì)照品儲(chǔ)備液各1.5 mL和1 mL，置同一10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液（灰乙、川乙濃度分別為0.253 2、0.213 5 mg·mL－1）。

3.3 對(duì)照藥材溶液 分別取金銀花和山銀花對(duì)照藥材粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理40 min，放冷，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為金銀花和山銀花對(duì)照藥材溶液。

3.4 供試品溶液 精密量取裝量項(xiàng)下的本品20 mL，加在D101型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑為2.0 cm，柱高為20 cm），用水200 mL洗脫，棄去水液，再用甲醇200 mL洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至干（溫度低于60℃），殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.5 陰性對(duì)照溶液 取“2.5”項(xiàng)下缺山銀花的陰性對(duì)照樣品，按“3.4”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.6 陽(yáng)性對(duì)照溶液 取“2.6”項(xiàng)下山銀花陽(yáng)性對(duì)照樣品，按“3.4”項(xiàng)下方法制成陽(yáng)性對(duì)照溶液。

3.7 方法學(xué)考察

3.7.1 專屬性 分別精密吸取“3.2”項(xiàng)下混和對(duì)照品溶液、“3.5”項(xiàng)下缺山銀花陰性對(duì)照溶液和3.6項(xiàng)下山銀花陽(yáng)性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，按“3.1“項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。山銀花投料制備的陽(yáng)性對(duì)照色譜中，呈現(xiàn)與灰乙保留時(shí)間相同的色譜峰；金銀花投料制備的正常樣品（陰性對(duì)照）色譜中無(wú)相應(yīng)色譜峰。綜上，上述檢測(cè)方法可以區(qū)分清熱解毒口服液樣品的金銀花投料情況。山銀花陽(yáng)性對(duì)照色譜中，川乙峰面積較小，不適合作為山銀花的檢出依據(jù)，故本方法學(xué)考察主要研究以灰乙作為山銀花的檢出指標(biāo)。

3.7.2 線性關(guān)系的考察 精密吸取“3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液各3、5、7、10、15、18、20μL，注入液相色譜儀，分別測(cè)定峰面積。以灰乙進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝1.693 3X＋4.486，r＝1.000。灰乙進(jìn)樣量在0.759 6～5.064 0μg之間，其自然對(duì)數(shù)與峰面積積分值自然對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

3.7.3 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取“3.2“項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液20μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，取灰乙峰面積自然對(duì)數(shù)，RSD為0.31%，表明儀器精密度良好。

3.7.4 檢測(cè)限和定量限 分別配制一個(gè)較低濃度的對(duì)照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，觀察其峰高與基線噪音的比值（即信噪比S／N），當(dāng)S／N等于3時(shí)，此時(shí)的濃度為檢測(cè)限，當(dāng)S／N等于10時(shí)，此時(shí)的濃度為定量限。灰乙的檢測(cè)限為0.025 3 mg·mL－1，定量限為0.050 6 mg·mL－1。

圖2 山銀花檢查專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖

3.7.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取企業(yè)D批號(hào)為13070005的樣品，照“3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，每隔5 h進(jìn)樣一次，測(cè)定色譜峰的峰面積，共考察25 h?；乙曳迕娣e自然對(duì)數(shù)的RSD為0.48%，表明供試品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7.6 重復(fù)性考察 取企業(yè)D批號(hào)為13070005的樣品，照“3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份。分別精密吸取“3.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液5、20μL及供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。以灰乙對(duì)照品進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝1.690 3X＋4.482 7，以標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品中的灰乙含量，6份樣品測(cè)定結(jié)果RSD為1.22%，方法重復(fù)性良好。

3.7.7 加樣回收率 取企業(yè)D批號(hào)為13070005的樣品，精密量取10mL（灰乙含量為0.550 1mg·mL－1），精密量取灰乙對(duì)照品溶液（濃度為1.495 9 mg·mL－1）3 mL和水7 mL置同一25 mL燒杯中，搖勻，照“3.4”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，平行制備6份。分別精密吸取“3.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液5、20 μL及供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，結(jié)果表明，測(cè)定方法的回收率良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.8 樣品測(cè)定 精密量取裝量項(xiàng)下的本品20 mL，照“3.4”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，平行制備2份。分別精密吸取對(duì)照品溶液5、20μL及供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，HPLC與TLC檢驗(yàn)結(jié)果一致。

表2 灰乙加樣回收率考察結(jié)果

4 討論

4.1 TLC法

4.1.1 考察了直接點(diǎn)樣、硅藻土除雜和D101大孔吸附樹(shù)脂除雜法。由于受到其他成分斑點(diǎn)的干擾，前兩種方法均無(wú)法準(zhǔn)確判斷是否檢出山銀花，而D101大孔吸附樹(shù)脂處理后，灰乙斑點(diǎn)清晰，可作為檢出山銀花的依據(jù)。

4.1.2 比較了日光和365 nm下兩種觀察方式，發(fā)現(xiàn)日光下無(wú)干擾，而365 nm下灰乙斑點(diǎn)附近略有干擾，可能影響結(jié)果判斷，因而選擇日光下觀察。

4.1.3 考察了乙酸丁酯－甲酸－水（7∶5∶5）的上層溶液和三氯甲烷－甲醇－水（6∶4∶1）兩種展開(kāi)劑。前一種展開(kāi)劑條件下，灰乙斑點(diǎn)的Rf值較小（約為0.2），在樣品圖譜中易受雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果判定，并且展開(kāi)時(shí)間較長(zhǎng)，故未采用。

4.1.4 考察了不同廠家硅膠G板（Merck公司和青島海洋化工分廠）及不同溫濕度條件（19℃，相對(duì)濕度44%；26℃，相對(duì)濕度33%），TLC色譜圖均斑點(diǎn)清晰、分離效果較好，證明TLC色譜條件耐用性較好。

4.2 HPLC法

4.2.1 HPLC流動(dòng)相還考察了乙腈（A）－0.4%磷酸溶液（B）梯度洗脫，梯度條件：0～10 min，11.5% A→15%A；10～12 min，15%A→29%A；12～18 min，29%A→33%A；18～30 min，33%A→45%A。該色譜條件下，供試品溶液中灰乙色譜峰與相鄰峰的分離度較差，故未采用。

4.2.2 考察了依利特Hypersil BDS、Thermo BDS和Kromasil 3種不同品牌的色譜柱（規(guī)格均為4.6 mm ×250 mm，5μm），灰乙色譜峰的對(duì)稱因子、理論板數(shù)和分離度等均符合要求，該方法對(duì)3種色譜柱適用性良好，對(duì)色譜柱選擇性不強(qiáng)。

4.2.3 根據(jù)灰乙的檢測(cè)限（0.025 3 mg·mL－1），建議規(guī)定清熱解毒口服液樣品中灰乙含量不得過(guò)0.03 mg·mL－1。

以建立的TLC和HPLC法考察4家生產(chǎn)企業(yè)的4批清熱解毒口服液，其中兩批樣品檢出山銀花，且遠(yuǎn)超出灰乙檢測(cè)限。根據(jù)本次檢驗(yàn)結(jié)果，清熱解毒口服液生產(chǎn)企業(yè)以山銀花代替金銀花投料的情況比較嚴(yán)重，增加山銀花的檢查是十分必要的。

［1］林永強(qiáng)，王淑華，徐麗華，等.金銀花與山銀花的鑒別方法研究［J］.藥學(xué)研究，2013，32（2）：69－71.

［2］林悅君，林旭文，倪少義，等.鑒別金銀花與山銀花要點(diǎn)探討［J］.中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（6）：125－126，129.

［3］李建軍，李軍芳，李景原，等.金銀花與山銀花的性狀差異及鑒別方法［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（4）：134－137.

［4］熊艷，朱晶晶，王智民，等.金銀花與山銀花HPLC指紋圖譜比較研究［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（9）：90－92，101.

［5］筆雪艷，王憲平，張清波，等.HPLC－UV－ELSD聯(lián)用法測(cè)定雙黃連系列制劑中連翹含量并同時(shí)檢查山銀花［J］.藥物分析雜志，2014，34（1）：104－107.

［6］李紅霞，王雪芹，李振國(guó)，等.不同產(chǎn)地金銀花與山銀花主要成分的含量比較［J］.中國(guó)藥房，2011，22（31）：2935－2937.

［7］筆雪艷，張清波，劉曉鳳，等.7種常用中藥制劑中金銀花與山銀花的應(yīng)用初探［J］.藥物分析雜志，2010，30（11）：2208－2211.

［8］吳飛燕，馮宋崗，曾建國(guó).金銀花和山銀花的鑒別與歸屬研究［J］.中草藥，2014，45（8）：1150－1156.

Inspection of Lonicerae flos in Qingre Jiedu Oral Solution

LIU Qing-zhi1，LIN Yong-qiang2，LIN Xiao2，GUO Dong-xiao2
（1.Shandong Pharmaceutical Industry Designing Institute，Jinan 250013，China；2.Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，China）

ObjectiveTo establish TLC and HPLC－ELSD methods for the inspection of Lonicerae flos in Qingre Jiedu Oral Solution.MethodsThe sample of Qingre Jiedu Oral Solution was chromatographed over a D101 macroporous resin column to enrich macranthoidin B，which was a characteristic component of Lonicerae flos and thus used as the detection index.Preliminary screening of the inspection was carried out with a TLCmethod；An HPLC－ELSD method was applied to determine the contentof Lonicerae flos.ResultsLonicerae floswas detected in samples supplied from two enterprises.ConclusionThemethodswere simple and accurate，which can be applied to detect the use of Lonicerae japonicae flos in Qingre Jiedu Oral Solution.

Qingre Jiedu Oral Solution；Lonicerae japonicae flos；Lonicerae flos；Macranthoidin B

R927.1

A

2095－5375（2014）10－0574－004

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制中藥安全檢測(cè)技術(shù)及標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)（No.2014ZX09304307）——中藥質(zhì)量安全檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)控制技術(shù)平臺(tái)（No.2014ZX0930437－002）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.ZR2013HM074）

劉青芝，女，研究方向：醫(yī)藥工藝設(shè)計(jì)，E－mail：qzhiliu＠gmail.com

郭東曉，男，主管藥師，研究方向：藥物分析，Tel：0531－81216523，E－mail：guodx0212＠126.com