注射用香菇多糖的抗腫瘤效應量效關系考察試驗研究

李雪梅，胡宇馳

（北京市藥品檢驗所，北京100035）

·實驗研究·

注射用香菇多糖的抗腫瘤效應量效關系考察試驗研究

李雪梅，胡宇馳

（北京市藥品檢驗所，北京100035）

目的觀察不同濃度的注射用香菇多糖對皮下植入S180腹水瘤小鼠實體腫瘤抑制率及藥物濃度與抑瘤率的量效關系。方法小鼠腹股溝皮下植入3.6×106個S180腹水瘤細胞后，每只腹腔注射不同濃度注射用香菇多糖溶液（0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.007 8 mg·mL－1）0.1 mL，連續注射5 d，然后停藥1 d，從給藥開始第7天起再連續注射5 d，腫瘤移植18 d后對腫瘤進行稱量。結果注射用香菇多糖各劑量組小鼠腫瘤重量明顯低于模型對照組，差異有顯著性意義；注射用香菇多糖給藥濃度在0.007 8～0.250 0mg·mL－1范圍內，其濃度對數－抑瘤率的回歸線性方程相關系數分別為：0.956、0.962、0.978。結論注射用香菇多糖具有明顯抗腫瘤作用，且給藥濃度對數－腫瘤抑制率有良好的線性關系。

注射用香菇多糖；腫瘤抑制率；量效關系

香菇多糖是從香菇中提取出來的有效部位，屬多糖組合體，其多糖類成分作為非特異性的免疫調節劑，通過激活免疫細胞，以及促進細胞因子生成等方式，對免疫系統發揮多方面的調節作用，最終達到抑制和消滅腫瘤細胞的作用。從上世紀七、八十年代來一直在腫瘤的治療和預防方面得到廣泛關注和應用。本文就注射用香菇多糖抗腫瘤作用及給藥濃度與腫瘤抑制率的關系進行研究［1～4］。

1 實驗材料與方法［5～8］

1.1 腫瘤系及其傳代與標準化 Sarcoma 180腹水腫瘤細胞由日本味之素制藥株式會社提供。本所進行傳代培養。用于試驗研究的腫瘤系需進行實體瘤標準化處理，將腹水瘤腫瘤細胞接種在小鼠腰部皮下，待實體瘤生長到8～10 g后，取下實體瘤，在培養皿內用剪刀或手術刀收集中部濕潤的部分，加入生理鹽水后，收集上清液中的細胞，然后注射至小鼠腹腔進行傳代，移植傳代3次（每周一次）后供試驗用。

1.2 試驗藥物 注射用香菇多糖，批號：OY01L；OY02L；0Y03L。規格：1 mg／支，生產單位：日本味之素制藥株式會社。

1.3 試劑 滅菌注射用水，批號：1212111，生產單位：天津藥業集團新鄭股份有限公司。氯化鈉注射液，批號：130305405，生產單位：石家莊四藥有限公司。

1.4 儀器 Olympus光學顯微鏡；天平。

1.5 實驗動物 SPF級，ICR小鼠，體重24～26 g，雌性，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。動物合格證號SCXK（京）2010－0002。

2 試驗方法

2.1 腫瘤接種 將已接種7 d，腫瘤生長良好的Sarcoma－180腹水型小鼠，脫臼處死后，把腹部皮膚撕開，暴露腹壁用無菌注射器從腹腔內吸取乳白色的濃稠腹水以氯化鈉注射液稀釋后，用血球計數板進行細胞計數。調整細胞數為3.6×107個·mL－1，制成腫瘤細胞懸液（活細胞率＞95%）。再將腹水瘤移植到雌性小鼠右側腰部皮下（腹股溝淋巴結左上方），每只皮下植入0.1 mL，即3.6×106個（細胞計數）。

2.2 動物分組及給藥 腫瘤植入后小鼠隨機分為7組：模型對照組（同體積滅菌注射用水）、注射用香菇多糖各劑量組（0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.0313、0.015 6、0.007 8 mg·mL－1），每組10只。從移植癌細胞第2天開始，每日動物腹腔注射不同濃度香菇多糖溶液0.1 mL，連續注射5 d。然后停藥1 d，從給藥開始第7天起再連續注射5 d。對照組腹腔同法注射滅菌注射用水0.1 mL。

2.3 檢測指標 腫瘤移植18 d后殺死全部動物，每只小鼠取出腫瘤、脾臟、胸腺，測定重量。計算出對照組動物腫瘤的平均重量（Wc）與給藥組的平均腫瘤重量（Wt），并按照下面公式求得各組動物腫瘤抑制率。

腫瘤抑制率（%）＝（Wc－Wt）／Wc×100%；

上式中Wc為對照組腫瘤平均重量，Wt為給藥組各劑量組的腫瘤平均重量。

各給藥組對給藥濃度對數－腫瘤抑制率進行回歸分析，計算濃度對數－抑瘤率的回歸線性方程及相關系數。

2.4 統計方法 用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析，數據以±s表示，采用方差分析方法，P＜0.05有統計學意義。

3 實驗結果

由表1試驗結果可見，批號為0Y01L的注射用香菇多糖濃度在0.031 3mg·mL－1以上時，小鼠腫瘤重量明顯低于模型對照組小鼠腫瘤重量（P＜0.01）；注射用香菇多糖濃度在0.062 5 mg·mL－1以上時，其腫瘤抑制率在85.01%以上。注射用香菇多糖在給藥濃度從0.007 8 mg·mL－1到0.25 mg·mL－1時，其抑瘤率從26.66上升至98.31%；小鼠胸腺重量、脾臟重量與模型對照組比較差異無顯著性意義。

批號為0Y02L的注射用香菇多糖濃度在0.125 mg·mL－1以上時，腫瘤重量明顯低于模型對照組，差異有顯著性意義（P＜0.05）；注射用香菇多糖濃度在0.062 5 mg·mL－1以上時，其腫瘤抑制率大于86.68%，且注射用香菇多糖給藥濃度從0.007 8到0.25 mg·mL－1時，其腫瘤抑制率從4.76%升至94.25%；小鼠胸腺重量、脾臟重量與模型對照組比較差異無顯著性意義。

批號為0Y03L注射用香菇多糖濃度在0.015 6 mg·mL－1以上時，注射用香菇多糖組小鼠腫瘤重量明顯低于模型對照組，差異有顯著性意義（P＜0.001）；注射用香菇多糖濃度在0.062 5 mg·mL－1以上時，其腫瘤抑制率大于87.72%。注射用香菇多糖給藥濃度從0.007 8到0.25mg·mL－1時，其腫瘤抑制率從24.79%升至98.64%。注射用香菇多糖濃度在0.25 mg·mL－1時，小鼠脾臟重量明顯低于模型對照組，差異有顯著性意義（P＜0.001）。

由圖1中可見，批號為0Y01L注射用香菇多糖其濃度對數－抑瘤率的回歸線性方程為Y＝44.82 ln（X）＋19.79，相關系數為0.956；批號為0Y02L注射用香菇多糖其濃度對數－抑瘤率的回歸線性方程為Y＝56.26ln（X）＋0.584，相關系數為0.962；批號為0Y03L注射用香菇多糖其濃度對數－抑瘤率的回歸線性方程為Y＝40.44ln（X）＋31.01，相關系數r值為0.978。

4 討論

惡性腫瘤是嚴重危害人類生命的疾病，其死亡率僅次于心腦血管疾病，且發生率呈逐年上升的趨勢。惡性腫瘤患者特別是晚期腫瘤患者可能出現令人無法忍受的疼痛、消瘦、水腫等癥狀并最終導致生命終結。現在世界醫藥界正在致力于癌癥的治療和預防工作。而香菇多糖作為抗腫瘤輔助治療作用藥物越來越受到人們的重視。香菇多糖是天然的多糖類成分，它主要通過提高機體非特異性免疫功能如誘導IL－2的產生，增強NK細胞及巨噬細胞活性等而起到對腫瘤細胞防御與殺傷作用。與其他抗癌藥相比，香菇多糖具有毒副作用小，療效顯著，因此其具有廣闊的應用前景。

表1 注射用香菇多糖腫瘤抑制率－濃度考察結果（n＝10）

圖1 注射用香菇多糖腫瘤抑制率－濃度考察結果

但香菇多糖為多組分生化藥物，不同生產工藝甚至不同批次香菇以及一些其他誤差，得到的產品具有不同的多糖組分比例以及不同的活性構型等，可能導致臨床中使用的香菇多糖制劑生物活性出現很大差異。因此，我們有必要對香菇多糖抗腫瘤活性的質量控制方法進行研究，建立可以證明香菇多糖抗腫瘤活性的方法，甚至進而建立可以比較不同工藝、不同生產單位和制劑活性的方法，或者證明已建立的化學檢定與其生物活性控制具有一致性，以更加科學地綜合評價香菇多糖制劑的質量，保證其臨床使用的抗腫瘤效果。

本試驗結果表明，3批次（0Y01L、0Y02L、0Y03L）注射用香菇多糖的一系列濃度（0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.007 8 mg·mL－1）對皮下植入Sarcoma－180腹水腫瘤細胞小鼠有抑制腫瘤生長的作用，腫瘤重量低于模型對照組，其腫瘤抑制率為4.76%～98.64%。3批次注射用香菇多糖給藥濃度在0.062 5mg·mL－1和0.031 3mg·mL－1以上時，其腫瘤抑制率在80%以上，說明注射用香菇多糖具有很強的抑制腫瘤生長的作用。

另外，此次試驗結果可見3個批次（0Y01L、0Y02L、0Y03L）注射用香菇多糖隨著給藥濃度的升高，其腫瘤重量隨之降低，腫瘤抑制率隨之升高。3個批次注射用香菇多糖給藥濃度在0.007 8～0.250 0 mg·mL－1范圍內，其濃度對數與抑瘤率的回歸線性方程相關系數分別為：0.956、0.962、0.978。回歸方程的相關系均大于0.95，由此可見，注射用香菇多糖的抗腫瘤活性與其劑量存在良好的量效關系。

脾臟為免疫器官，批號為0Y03L注射用香菇多糖在藥物濃度為0.25 mg·mL－1時，其脾臟重量顯著低于模型對照組。批號為0Y01L、0Y02L注射用香菇多糖，雖然脾臟重量與模型對照組比較差異無顯著性意義。但由數據我們可以看出，注射用香菇多糖各給藥組動物脾臟重量均低于模型對照組。由此我們推斷，注射用香菇多糖增強腫瘤小鼠免疫功能的作用［7］。

由此可見，注射用香菇多糖對Sarcoma－180腹水腫瘤細胞小鼠有明顯抑制腫瘤的作用，其腫瘤抑制率最高可以達到95%以上，且給藥濃度的對數－腫瘤抑制率成良好的線性關系，這樣就為我們對注射用香菇多糖抗腫瘤活性質量控制提供依據，為下一步建立注射用香菇多糖抗腫瘤活性生物效價檢定法奠定基礎。

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The study on dose－effect relationship about anti－tumor activity of Lentinan for Injection

LIXue-mei，HU Yu-chi
（Beijing Institute for Drug Control，Beijing 100035，China）

ObjectiveTo observe the effect about different concentration of Lentinan for Injection on mouse tumor inhibitory which was implant sarcoma 180 cells by subcutaneous administration and dose－effect relationship.M ethodsICR mice were implant3.6×106sarcoma 180 cells by subcutaneous groin，then eachmouse was injected 0.1 mL different concentration solution of Lentinan for Injection（0.250 0，0.125 0，0.062 5，0.031 3，0.015 6，0.007 8 mg·mL－1）by intraperitoneal administration.Themice were injected Lentinan Solution for Injection 5 days continually，then stop 1 day，mice were injected again for 5days continually.Mice were killed who was implanted sarcoma 180 cells after 18 days，tumour was weighted.ResultsThe mice′s tumour weight in Lentinan for Injection groups significantly lower than model control group.When the concentration between 0.007 8 mg·mL－1and 0.250 0 mg·mL－1，the correlation coefficient of linear regression equations between logarithm of concentrations and tumor inhibitory rate were 0.956，0.962，0.978，respectively.ConclusionLentinan for Injection had antitumor action.Therewere linear relationships between logarithm of concentrations and tumor inhibitory rate.

Lentinan for Injection；Tumor inhibitory rate；Dose－effect relationship

R965

A

2095－5375（2014）10－0564－004

李雪梅，女，主管藥師，研究方向：藥物安全評價臨床前研究，E－mail：lixuemei＠bidc.org.cn

胡宇馳，男，副主任藥師，研究方向：藥物安全評價臨床前研究，Tel：010－83229474，E－mail：yuchihu＠163.com