南黃海沿岸灘涂文蛤中痕量硒的周年變化探討

凌 云, 萬夕和, 王李寶, 黎 慧, 沈 輝, 陳玉生

(江蘇省海洋水產研究所, 江蘇 南通 226007)

南黃海沿岸灘涂文蛤中痕量硒的周年變化探討

凌 云, 萬夕和, 王李寶, 黎 慧, 沈 輝, 陳玉生

(江蘇省海洋水產研究所, 江蘇 南通 226007)

采用 4∶1混合酸濕法消解, 氫化物發生原子熒光光譜法(HG-AFS)測定了南黃海沿岸灘涂文蛤生物體中微量元素硒的周年變化, 并用質控樣和加標回收保證結果的可靠性。結果顯示:硒的周年含量為0.2～0.5 mg/kg, 平均值為0.330 mg/kg, 文蛤體內硒的含量呈一定規律性變化, 春、秋季高, 夏、冬季低。說明文蛤中硒含量因不同季節而具有明顯差異, 其含量變化與海水溫度、餌料生物及文蛤生長繁殖等因素有關。

原子熒光光譜法; 南黃海; 文蛤(Meretrix meretrixLinnaeus); 硒; 周年變化

文蛤(Meretrix meretrixLinnaeus)是常見的可食用雙殼貝類, 屬軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、真瓣鰓目(Eulamellibranchia)、簾蛤科(Veneridae)、文蛤屬(Meretrix)[1]。文蛤屬于廣溫性貝類, 在我國沿海各省均有分布, 是我國海水養殖的重要經濟貝類之一。南黃海沿岸灘涂是文蛤的重要棲息地, 其產量占全國 50%以上。文蛤是蛤中上品, 被譽為“天下第一鮮”, 不但味道鮮美, 而且具有很高的營養價值[2]。

硒(Se)是人體和動物體必需的重要微量元素,是谷胱甘肽過氧化酶的重要組成成分, 它參與多種代謝, 具有抗氧化、增強免疫力、調節機體代謝以及降低有毒元素毒性等功能[3-5]。硒在一般生物樣品中含量較低, 并因種類不同而差異較大。動物制品的硒含量比植物體高, 海洋生物中硒類的含量也比陸地生物多[6]。海洋生物是硒良好的食物來源, 硒的攝入不足會給人和動物造成多種傷害, 影響生物體的正常功能, 損害機體免疫力, 造成多種疾病, 而過量的硒又會在體內造成毒性傷害[7]。

目前, 測定Se含量的方法主要有2,3-二氨基萘熒光法、石墨爐原子吸收法、催化極譜法、高效液相色譜法和氫化物-原子熒光光譜法(HG-AFS)等[8-9]。HG-AFS法具有檢出限低, 操作簡便, 基體干擾少,靈敏度高, 分析結果穩定可靠, 且避免使用有機和有毒試劑等優點[8], 故選用此法進行測定。

已有學者開展過硒在貝類體內的分布特點[10]及存在形式[11]研究、各種海洋貝類中硒的含量測定分析[12-14]、采用新方法測定硒的含量[15]等方面研究, 但連續研究貝類中硒的含量變化未見報道, 本研究從南黃海沿岸灘涂養殖貝類文蛤入手, 研究了文蛤生物體內硒含量的周年變化, 分析不同生物季節文蛤體內硒含量差異, 并探討了相關影響原因, 為合理食用貝類、了解其生理周期代謝提供基礎研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

樣品文蛤取自南黃海灘涂典型輻射沙脊群-腰沙,于每月農歷十五大潮退潮后取樣, 取樣量至少1.5 kg,連續取樣1年(從2011年6月～2012年5月, 2012年1月未取樣), 樣品經現場海水沖洗干凈, 采樣后放于海水中暫養排掉泥沙, –20 ℃冷凍保存備用。采樣同時測定海水溫度, 取兩次平均值記錄。

樣品制備: 冷凍文蛤樣品經室溫解凍, 剖開殼體, 取所有柔軟組織用自來水和純水沖洗干凈, 瀝水, 用勻漿機攪碎后, 混勻備用。

扇貝質控樣(GBW10024)購自中國計量科學院化學所。

1.2 儀器與試劑

AFS-9800型原子熒光光譜儀(北京海光儀器有限公司), 附帶硒空心陰極燈和純度為99.99%的氬氣作載氣; EH35APlus型數顯電熱板(北京萊伯泰科公司);

實驗用水為超純水, 硝酸、高氯酸、鹽酸、氫氧化鉀、硼氫化鉀均為GR; 硒標準物質(1000 mg/L): GBS04-1751-2004, 購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心, 硒標準中間液質量濃度為10 μg/mL, 硒標準工作液質量濃度為100 μg/L; 100 g/L鐵氰化鉀溶液。

1.3 標準曲線的配制

分別吸取硒標準工作液 0.0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mL于20 mL比色管中, 定容至10 mL。再分別加入2.0 mL濃鹽酸, 1.0 mL鐵氰化鉀溶液, 混勻, 放置20 min。還原劑為1.5%硼氫化鉀, 載液為5%鹽酸。

本實驗需要使用Ig M抗D血型定型試劑、單克隆抗體抗A抗血型定型試劑、不規則抗體篩選試劑、抗人球蛋白(抗IgG)檢測卡等,由上海血液生物醫藥公司、江蘇力博醫藥生物技術股份有限公司等提供。需要注意的是,在使用各種試劑時需要注意試劑的使用期限,還應避免不同批次混用,防止對實驗最終結果產生不良影響。

1.4 樣品前處理

采用濕法消解方法, 稱取處理好的文蛤樣品約2 g (精確至0.0001 g), 放入150 mL三角燒瓶中, 加10 mL HNO3+HClO4(4+1)混合酸, 搖勻, 冷消解過夜。次日于電熱板上低溫加熱消化, 當溶液變為清亮無色并伴有白煙時, 繼續加熱至剩余體積2 mL左右, 冷卻至室溫。再加5 mL(1+1)鹽酸溶液, 繼續加熱至溶液變為清亮無色并伴有白煙冒出。冷卻至室溫, 轉移至50 mL比色管中, 用純水定容, 搖勻后靜置。取10 mL文蛤消解液置于比色管中, 加入2 mL濃鹽酸、1 mL鐵氰化鉀溶液, 混勻待測。同時做空白試驗。

1.5 儀器測定及計算

儀器條件設置: 負高壓: 300 V; 燈電流: 80 mA;原子化高度: 8 mm; 屏蔽氣流量: 900 mL/min; 載氣流量: 400 mL/min; 測量方式: 標準曲線法; 讀數方式: 峰面積; 延遲時間: 2 s; 讀數時間: 12 s。待儀器穩定20 min后開始測量。

試樣測定結果按以下公式計算:

式中,X為試樣中硒的含量, mg/kg;C為試樣消解液測定濃度, mg/L;C0為試樣空白消解液測定質量濃度, mg/L;m為試樣質量, g;V為試樣消解液總體積, mL。

1.6 數據統計分析

采用SPSS statistics19軟件進行單因素方差分析和LSD多重比較, 以P<0.05作為顯著性水平。

2 結果與討論

2.1 標準曲線、檢出限和精密度

按儀器條件, 以5%HCl為載體, 1.5% KBH4為還原劑, 測得的Se元素的線性回歸方程為y=35.006x+ 8.3404, 相關系數R2為0.9990, 擬合度良好, 結果可靠, 見表1。

表1 硒標準曲線測定Tab.1 Standard curves of selenium

交替測定預處理空白和標準溶液, 取11次連續測量空白溶液的熒光信號的標準偏差, 乘以標準曲線的斜率, 得出檢出限為0.255 μg/L。以質量濃度為20 μg/L的硒標準溶液進行精密度的測定, 實驗測得精密度為5%, 滿足精密度要求。

2.2 質控樣含量及回收率測定

表2 質控樣加標回收率測定Tab.2 Measurement on recovery of the labeled quality control samples

質控樣扇貝(GBW10024)稱樣量為0.5 g(精確至0.0001 g), 在上述實驗條件下, 對扇貝中的硒進行測定。連續3次測定扇貝中硒含量分別為1.208、1.310、1.241 mg/kg, 平均值為 1.253 mg/kg, 相對標準偏差RSD為4.15%, 扇貝標準物質證書上給出的硒含量值為 1.5 mg/kg±0.3 mg/kg, 測定結果在誤差允許范圍內。則扇貝稱樣量為0.5 g時, 含硒量為625.5 μg。

稱取0.5 g扇貝質控樣9份, 分別加入3種不同濃度的 Se標準溶液進行加標回收實驗, 平行 3次,按上述方法測其含量, 取其平均值, 由表 2結果可見, 加標回收率為97.3% ～114.4%。可見采用該方法測硒具有很好的可行性和準確性。

2.3 測定結果與分析

2.3.1 檢測結果數據

將一年內不同月份的文蛤進行總硒含量測定,測定結果見表3。每份樣品進行3次平行樣測定, 計算平均值及相對標準偏差, 結果顯示RSD值≤10%,能滿足食品中硒的測定要求。一年內文蛤硒含量的平均值為 0.330mg/kg,最高值出現在 5月份, 為0.447 mg/kg, 最低值出現在8月份, 為0.247 mg/kg。測定結果可以看出文蛤新鮮樣品中硒含量呈一定規律性變化, 5月份和11月份相對較高, 3月份和8月份相對較低, 呈現由高到低再到高的周期性變化趨勢。

表3 一周年內文蛤生物體中硒含量測定結果Tab.3 Annual measurement on the selenium content in Meretrix meretrix (mg/kg)

2.3.2 不同季節硒含量的變化差異分析

一周年不同月份采集文蛤時記錄的海水溫度制成的海水表層溫度變化趨勢見圖1, 2011年8月海水溫度為最高, 2012年2月海水溫度為最低。將不同月份采集文蛤時海水溫度變化與文蛤中硒含量變化進行相關性分析, 通過圖 1可以看出, 2011年 6月至2011年10月文蛤體中硒含量與海水溫度變化呈相反趨勢, 在2011年11月至2012年5月, 海水溫度與文蛤體中硒含量呈相同趨勢。

圖1 不同月份海水溫度與文蛤硒含量的變化趨勢Fig. 1 Variation tendency of sea water temperature and the selenium content in Meretrix meretrix

將取樣文蛤按照生物季節劃分, 10～20 ℃左右的4月、5月、6月為春季, 20～30 ℃的7月到9月為夏季, 15～20 ℃的10到12月為秋季, 10 ℃以下的1月到 3月為冬季, 將文蛤生物體中硒的含量根據不同季節用SPSS軟件進行單因素ANOVA分析和LSD多重比較(表 4), 結果表明文蛤生物體內硒含量在季節間差異極顯著(P<0.01)。

將不同季節文蛤中硒的含量進行LSD多重比較,可以得出春季文蛤中硒含量與夏季、冬季文蛤中硒含量差異極顯著(P<0.01), 與秋季文蛤中硒含量差異顯著(P<0.05); 夏季文蛤中硒含量和秋季、冬季比較相近, 差異不顯著(P>0.05), 秋季文蛤中硒含量和冬季差異不顯著(P>0.05)。

2.3.3 文蛤體中硒含量周年變化原因討論

文蛤常棲息在河口附近沿岸的潮間帶以及淺海區的細沙或泥沙灘中, 營埋棲生活, 通過濾水作用攝取海洋中的浮游植物和有機碎屑為食。張安國等[1]研究了不同地理種群文蛤體內營養成分差異, 認為文蛤缺乏嚴格的選擇餌料能力, 其攝食的最主要種類是硅藻, 這有很大的地區性和季節性的變化, 不同地區和不同季節, 水中餌料生物和底棲藻類繁殖情況不一。季節變化對文蛤攝食生理參數的影響主要表現為水溫和餌料濃度的影響。

硒在海洋環境中含量極少, 屬微量元素, Donald B等[16]、George L. Bowie等[17]研究認為, 硒是海洋微藻的一種基本生長調節劑, 是生物必需的微量元素, 極易被浮游植物所吸收, 并且可隨食物鏈傳遞,在生物體內累積。楊逸萍等[18]通過研究海水和藻液中硒的含量, 得出海洋浮游植物對硒的富集系數高達104以上。毛文君等[10-11]研究了貝類中硒的分布特點, 認為貝類生物體的外套膜中硒含量最高。外套膜是貝類與外界溝通的唯一管道。由此推測文蛤體內的硒是因攝食餌料微藻而獲取, 硒含量高低受攝取微藻含量多寡影響。

表4 不同季節文蛤生物體中硒含量的平均值和標準差及單因子方差分析(ANOVA)結果Tab.4 The mean, standard deviations and results of one-way ANOVA for the selenium content in Meretrix meretrix in different seasons

文蛤是變溫動物, 環境溫度對其生長發育影響也很大。徐東等[19]、林小濤等[20]研究了海水溫度對貝類攝食生理的影響, 結果表明, 在一定適溫范圍內, 貝類的攝食率隨溫度升高而增大, 到達某一溫度達到最大, 其后溫度升高攝食率反而下降。探究其機理, Joergensen等[21]認為溫度和貝類鰓絲纖毛的擺動呈正相關性。當溫度過低時, 纖毛擺動的強度與頻率下降, 使其攝食能下降; 隨著溫度升高使纖毛的擺動頻率加快, 且高溫可以減少海水的黏滯性, 從而使其濾水能力增加, 使攝食能增加。徐東等[19]認為適宜的溫度范圍內, 溫度升高使貝類的生命活動加強, 新陳代謝加快, 濾水率加快, 攝食率隨之增大;當水溫超過一定的范圍, 環境條件變得不再適宜時,貝類的生命活動受到限制, 攝食率則下降。作者認為兩者說法都有一定道理, 貝類攝食受溫度影響存在被動吸收和主動運輸兩方面的因素, 溫度影響著貝類本身的生理代謝狀態。

通過對文蛤體內硒的周年測定可見, 文蛤體內硒含量呈一定規律性變化, 在春秋兩季比較高, 而在冬夏兩季相對較低。在前人的研究基礎上, 作者認為硒含量的變化是因為硒被海洋浮游藻類吸收, 通過食物鏈傳遞被貝類攝取, 參與了文蛤體內生理代謝。不同季節, 浮游藻類繁殖能力和數量隨溫度的變化而改變,文蛤餌料中硒的含量也隨之改變。在春秋兩季海水溫度相對適宜, 藻類繁殖旺盛, 餌料豐富, 文蛤攝食時間較長, 文蛤適合生長, 其體內硒含量比較高。

文蛤的繁殖期因海區水溫不同各地早晚不一樣,一般在水溫20～30 ℃繁殖, 江蘇文蛤在6月到7月繁殖。繁殖前, 軟體積累大量營養物質, 為產卵作好準備, 此時軟體最肥, 文蛤體內富集的硒含量也比較高,因此5月份文蛤體中硒含量為最高。繁殖期間軟體消瘦, 生長緩慢, 繁殖后肥滿度降低, 營養物質損失, 體質虛弱, 貝類生長速度較慢, 硒含量逐漸降低,同時8月海水溫度較高, 酶蛋白易變性, 文蛤生長代謝受到一定程度抑制, 因此表現為6月到8月份硒含量逐漸降低, 8月份文蛤體中硒含量為最低; 隨著 9月到11月海水溫度的逐漸下降到適宜范圍內, 藻類生長旺盛, 文蛤由繁殖期轉為生長期, 文蛤的生理代謝增強, 硒含量逐漸增加; 到12月份時海水溫度降至 15 ℃以下, 文蛤的生長代謝下降, 文蛤體內硒含量則由高降低, 在次年2月、3月海水溫度低于10 ℃以下, 餌料相對少, 文蛤體內酶活性受抑制, 文蛤生長緩慢, 文蛤體內硒含量處于較低狀態; 而到4月份時海水溫度上升至 10 ℃以上, 海洋藻類逐漸豐富, 貝類攝食量增大, 體內酶活性高, 生長旺盛, 到5月份文蛤體內營養物質豐富, 為繁殖做準備, 文蛤體中硒含量比較高。綜上所述, 可以推測文蛤體內硒含量呈周期性變化的原因在于受到海水溫度、餌料生物環境因子及文蛤本身生理狀態(繁殖期、生長期)的影響所致。

3 結 論

通過本實驗表明不同月份不同季節文蛤貝類中的硒含量呈現一定規律變化, 表現為春、秋兩季硒含量高, 夏、冬兩季硒含量低, 不同季節文蛤體中硒含量差異顯著。這提醒我們在采集樣品檢測營養成分時,要選擇合適的采集時間, 肥滿度比較高的季節即在其繁殖節前采集才能檢測其最高的含量。不同采集時間,采集地域跨度大, 對測定結果會有直接影響。

本研究初步探討了文蛤體中硒含量周年變化的形成原因, 認為與海水溫度高低、餌料生物多寡以及貝類體內的生理狀態(繁殖期、生長期)等因素有關,但其深層次的機理還有待進一步實驗驗證。

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(本文編輯: 梁德海)

Annual variation of trace selenium content inMeretrix meretrixin the South Yellow Sea tidal flats

LING Yun, WAN Xi-he, WANG Li-bao, LI Hui, SHEN Hui, CHEN Yu-sheng
(Institute of Oceanology & Marine Fisheries, Nantong 226007, China)

Dec, 27, 2012

HG-AFS, South Yellow Sea,Meretrix meretrix, selenium, annual variation

The anniversary changes of trace element selenium inMeretrix meretrixin the South Yellow Sea tidal flats were measured by hydride generation atomic fluorescence spectrometry (HG - AFS) following a 4∶1 mixed acid to wet digestion and the reliability of the method with quality control samples and the recovery of standard were studied and verified. The results showed the content of selenium was between 0.2～0.5×10-6mg/kg with an average value of 0.330×10-6mg/kg. The selenium inMeretrixshowed regularity changes in different seasons. The content of selenium is higher in spring and autumn, and lower in summer and winter. The selenium inMeretrixhad obvious different content in different seasons, which was connected with seawater temperature, food organism andMeretrixgrow and breed and so on.

O657.32

A

1000-3096(2014)01-0039-05

10.11759/hykx20121227003

2012-12-27,

2013-08-06

國家海洋公益性行業科研專項(2013418007-1); 國家科技支撐計劃項目(2012BAC07B03); 江蘇省農業科技自主創新資金項目(CX(13)3094)

凌云(1982-), 女, 江蘇南通人, 助研, 碩士研究生, 主要從事海洋生態學研究, 電話: 0513-85228274, E-mail: lingyun 20110520@163.com;萬夕和, 通信作者, 研究員, 博士, E-mail: wxh1708@ 163.com