氧載體對番茄紅素發酵影響

王英燕，張芙蓉，田智斌

（江蘇神華藥業有限公司，江蘇金湖211600）

氧載體對番茄紅素發酵影響

王英燕，張芙蓉，田智斌

（江蘇神華藥業有限公司，江蘇金湖211600）

目的研究氧載體對番茄紅素發酵的影響。方法在前期預實驗的基礎上，獲得正己烷，正庚烷，正十六烷的最適添加濃度分別為0.2%、0.3%和1%；最適添加時間是發酵初期第0 h。采用Box－Behnken設計對3種氧載體添加量的協同作用進行優化。結果根據最優預測結果，最終得到番茄紅素產率為2.53 g·L－1，對應的氧載體添加量分別為正己烷0.30%，正庚烷0.25%，正十六烷0.88%。結論添加適宜比例的氧載體對番茄紅素的發酵具有正向促進作用。

氧載體；番茄紅素；發酵；Box－Behnken

番茄紅素是膳食中的一種天然類胡蘿卜素，廣泛存在于自然界的植物中，在人體各組織器官中也有較多分布。番茄紅素有比其他類胡蘿卜素更好的生物活性，并且是防病治病的重要功能因子，已成為目前國際上功能食品成分研究的一個熱點，在醫藥、食品、化妝品等方面都有著良好的應用前景［1，2］。如何提高番茄紅素產率是實現工業化生產的關鍵因素。在以往的研究中，很多學者通過菌種誘變，培養基條件優化，生產工藝條件優化等手段提高番茄紅素的產量。其中，如何增加發酵體系的溶氧水平也是一個重要的研究方面。隨著發酵過程的進行，微生物開始大量繁殖，對氧氣需求量增大，同時菌體的生長伴隨著番茄紅素的大量合成，黏度的急劇增加嚴重阻礙了氧氣的傳遞。較低的溶氧水平是限制番茄紅素產量提高的一個關鍵因素。氧載體是一種對微生物無毒、具有較高溶氧能力的有機物，一般具有比水更高的溶氧能力。液態烷烴，正十二烷，全氟化碳等均可作為氧載體。這類有機溶劑與水不相溶，能夠把氧較快的傳遞給發酵液，

從而提高液相中氧的溶解度［3，4］。Liu等［5］的研究表明在發酵體系中添加正十二烷可以提高透明質酸的產量和分子量；Giridhar等［6］發現正十六烷可以提高L－山梨糖的產量；Umesht等［7］通過在培養基中添加液態石蠟和正十二烷提高L－天冬酰胺酶的酶活。

但對添加氧載體提高番茄紅素產量的研究數據還很少。本文研究了添加不同氧載體對發酵生產番茄紅素的影響，并對氧載體的添加濃度進行了優化，為實現番茄紅素大規模工業化生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株 三孢布拉氏霉菌ATCC14271（＋），三孢布拉氏霉菌ATCC14272（－），均購自ATCC。

1.2 儀器和設備 恒溫培養箱、恒溫搖床、30 L全自動發酵罐、超凈工作臺、高速離心機、干燥箱。

1.3 培養基 種子培養基（g·L－1）：淀粉40，玉米漿40，葡萄糖25，KH2PO40.5，MgSO40.25，VB少許，用稀鹽酸調節pH至6.5，在121℃滅菌30 min，備用。

PDA斜面培養基（g·L－1）：土豆提取液1.0 L、葡萄糖20，瓊脂20，VB少許，在121℃滅菌30min，備用。

發酵培養基（g·L－1）：淀粉10，淀粉糖化液30，玉米漿40，KH2PO40.5，MgSO40.25，VB少許，用稀鹽酸調節pH至6.5。

1.4 培養條件

1.4.1 孢子懸浮液制備 將三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）原菌經活化后，分別接種于PDA斜面培養基上，在28℃條件下，培養箱中培養72 h，然后在有氧、有光的環境中，于18℃再繼續培養48 h，可得生長良好的三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）菌孢子，分別挑取三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）的孢子囊接入已滅菌的生理鹽水中，并用磁力攪拌器攪拌，制得孢子懸浮液。

1.4.2 發酵培養 將培養良好的三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）菌孢子懸浮液在無菌條件下按1∶2的體積比混合制成種子液。在30 L的發酵罐中加入5 L初始發酵培養基，經121℃、30 min滅菌后，在無菌條件下接入種子液，在28℃條件下進行發酵。

1.5 氧載體 正庚烷，正己烷為分析純；正十二烷，正十六烷為進口分裝。

1.6 分析方法 細胞干重（DCW）的測定：將發酵液離心，把濕菌體置80℃烘箱干燥至恒重后稱重。

番茄紅素含量的測定參考文獻［8］。

1.7 試驗方法 前期預實驗篩選出了可促進番茄紅素產量的氧載體分別為正己烷，正庚烷和正十六烷，其最佳添加濃度分別為0.2%、0.3%和1%。在此條件下對發酵過程的不同時期添加氧載體，確定氧載體的最佳添加時間。進而采用Box－Behnken設計對幾種氧載體的協同濃度作進一步的優化。其中Box－Behnken采用Design Expert 8.0數據分析軟件分析結果。

2 結果與討論

2.1 氧載體添加時間的選擇 考慮到添加劑正己烷和正庚烷在高濃度時對菌體存在一定的抑制作用，因此有必要研究添加時間對番茄紅素生物合成的影響。選擇添加劑正庚烷、正己烷和正十六烷，測定不同添加時間對番茄紅素發酵的影響。選擇在發酵的不同時期（0、24、48、72 h）分別添加0.2%正己烷、0.3%正庚烷和1%正十六烷，考察對發酵生產番茄紅素的影響。結果如圖1所示，上述幾種氧載體在發酵48 h加入時，對菌體生長和產物合成都有明顯的抑制作用，可能菌體生長在此時處于對數生長期，外源有機溶劑的添加會對該階段的細胞生長有一定的抑制作用，進而影響到穩定期番茄紅素的合成。其余時間點加入氧載體對番茄紅素的生物合成影響不大，其中0 h加入氧載體的效果最好。在后續研究中均在發酵初始加入各種氧載體添加劑。

圖1 氧載體不同添加時間對番茄紅素發酵的影響

2.2 氧載體對番茄紅素生物合成的協同作用

2.2.1 氧載體協同作用對番茄紅素發酵的影響利用Box－Behnken設計對正庚烷、正己烷和正十六烷三種氧載體協同作用濃度作進一步的優化。各因素及其水平見表1，Box－Behnken設計結果如表2所示。每個因素3個水平，中心點上作3個重復設計。

表1 Box－Behnken試驗設計因素與水平

表2 Box－Behnken試驗設計與結果

續表2：

以番茄紅素產量為響應值，采用Design Expert 8.0軟件對表2中的試驗數據進行多元回歸分析，結果見表3。最小二乘法擬合二次多項式方程，試驗因子與響應值得關系可用以下方程表示：

由表3可知，所選模型的不同處理間差異極顯著，說明采用該回歸方程描述各因子與響應值之間的關系時，其響應變量與自變量之間的二次線性關系顯著，即該試驗方法可靠；決定系數R2＝94.74%表明相關性較顯著；失擬項差異不顯著，表明該多項式對試驗數據擬合情況較好，試驗誤差較小；R2

Pred值為79.97%也能較合理地說明校正決定系數RAdj2＝85.28%的變化，僅4.14%的試驗數據不能用此模型來解釋，信噪比大于4。因此，可以用該方程代替各組試驗對試驗結果進行分析和預測。

表3 Box－Behnken試驗因素方差分析表

保持其中單一因素最優條件，其他兩個因素與響應值關系用響應面圖和等值線圖表示（如圖2、圖3、圖4所示）。根據回歸模型預測出番茄紅素的最高產量，即添加正己烷0.30%、正庚烷0.25%、正十六烷0.88%時，番茄紅素產率為2.53 g·L－1。

圖2 正庚烷和正己烷交互效應對番茄紅素產量的影響

2.2.2 回歸試驗模型驗證 為證實預測值與真實值之間的擬合程度，進行3次平行驗證試驗，即在添加正己烷0.30%、正庚烷0.25%、正十六烷0.88%時發酵生產番茄紅素，其產量分別為2.42、2.58、2.49 g·L－1，試驗值與模型估計值最大相差1.3%，二者非常接近，表明預測值與試驗值有較好的擬合性，進一步驗證了該模型的可信程度。

3 結論

正己烷、正庚烷及正十六烷都能夠明顯促進番茄紅素的生物合成，在發酵初始分別添加0.2%正己烷、0.3%正庚烷和1%正十六烷，番茄紅素產率分別為2.37、2.29和2.25 g·L－1。進一步通過響應面法Box－Behnken試驗設計優化了三者的協同濃度，回歸模型預測出在添加正己烷0.30%、正庚烷0.25%、正十六烷0.88%時，番茄紅素最高產率為2.53 g·L－1，試驗值與預測值擬合良好，達到了優化試驗設計的目的。該實驗具有重要的生產實踐及理論指導意義，可為大規模工業化生產番茄紅素奠定了一定基礎。

圖3 正庚烷和正十六烷交互效應對番茄紅素產量的影響

圖4 正己烷和正十六烷交互效應對番茄紅素產量的影響

［1］Rao AV，Agarwal S.Role of lycopene as antioxidant carotenoid in the prevention of chronic diseases：A review［J］.Nutrition Research，1999，19（2）：305－323.

［2］傅喆暾，袁杰，黃雄偉，等.番茄紅素的研究概況及應用前景［J］.現代中藥研究與實踐，2007，21（1）：58－61.

［3］賈士儒，李小明，包志泉，等.氧載體強化傳氧的研究Ⅰ［J］.天津輕工業學院學報，1994，9（1）：7－12.

［4］賈士儒，袁玉華，包志泉.氧載體強化傳氧的研究Ⅱ［J］.天津輕工業學院學報，1995，10（1）：1－7.

［5］Liu L，Yang H，Zhang D，etal.Enhancementofhyaluronic acid production by batch culture of Streptococcus zooepidemicus with n－dodecane as an oxygen vector［J］.JMicrobiol Biotechnol，2009，19（6）：596－603.

［6］Giridhar R，Srivastava AK.Productivity enhancement in l－sorbose fermentation using oxygen vector［J］.Enzyme Microbial Technol，2000，27：537－541.

［7］Narta U，Rov S，Kanwar SS，et al.Improved production of L－asparaginase by Bacillus brevis cultivated in the presence of oxygen－vectors［J］.Biores Technol，2011，102（2）：2083－2085.

［8］張邦建，王海峰，侯成林.發酵法生產番茄紅素工藝的研究［J］.食品工程，2008，4：14－16.

Effect of oxygen－vector on lycopene fermentation

WANG Ying-yan，ZHANG Fu-rong，TIAN Zhi-bin
（Jiangsu Shenhua Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jinhu 211600，China）

ObjectiveTo research the effect of oxygen－vector on lycopene fermentation process.M ethods The results of preliminory experiment showed that the optimal concentration of n－hexane，n－heptane，n－hexadecane added to themedium were 0.2%，0.3%and 1%，respectively.And the optimal adding timewas0 h.The Box－Behnkenmethod was used for the optimization of lycopene production by adding oxygen－vectors.ResultsWhen the fermentation was used under the optimal condition，the lycopene concentration reached 2.53 g·L－1，with the optimal concentration of n－hexane，n－heptane，n－hexadecane added to themedium were 0.30%，0.25%and 0.88%，respectively.ConclusionThe appropriate proportion of oxygen－vector had a positive role in lycopene fermentation process.

Oxygen－vector；Lycopene；Fermentation；Box－Behnken

TS202.1

A

2095－5375（2014）04－0196－004

王英燕，女，研究方向：藥品與食品研究，E－mail：wyy408＠126.com