Taguchi正交法優化奧沙利鉑長循環脂質體的制備

Cheraga Nihad，沈 雁，涂家生

（中國藥科大學藥劑學教研室，江蘇南京210009）

·實驗研究·

Taguchi正交法優化奧沙利鉑長循環脂質體的制備

Cheraga Nihad，沈 雁，涂家生

（中國藥科大學藥劑學教研室，江蘇南京210009）

目的通過優化奧沙利鉑（L－OHP）長循環脂質體的制備工藝，以提高其包封率（entrapment efficiency，EE%）并達到緩釋效果。方法采用Taguchi正交法L9（34）（TOA），以包封率作為考察指標并采用超濾法檢測包封率。考察了L－OHP脂質體的粒徑、zeta電位、形態以及體外釋放行為。結果藥物與脂質間的比例（W／W），膽固醇與磷脂酰膽堿的比值（M／M）和超聲時間是影響最大的三個因素（P＜0.05）。此外，優化后的奧沙利鉑脂質體經mPEG修飾后與未修飾的奧沙利鉑脂質體相比較，具有更好的物理化學特性，其粒徑為（204±1.1）nm，包封率高達25.40%±2.5%。修飾后的脂質體在透射電子顯微鏡下呈現球形結構，具有較大的內部空間，脂質體表面可見白色mPEG層狀結構。經mPEG修飾的奧沙利鉑脂質體相比于未修飾的脂質體，具有更低的體外釋放速率，具有一定緩釋能力。修飾與未修飾的脂質體以及奧沙利鉑溶液均符合一級釋放模型，擬合系數為0.990 2。結論經Taguchi正交法優化后的奧沙利鉑長循環脂質體可作為一種新型的腫瘤靶向藥物傳遞系統。

Taguchi正交法；mPEG修飾；脂質體；奧沙利鉑；藥物傳遞系統

奧沙利鉑（L－OHP）屬于第三代鉑類抗腫瘤化 合物。現已批準奧沙利鉑與5－氟尿嘧啶（5－FU）／亞葉酸鈣（FOLFOX）［1，2］聯合用藥，是臨床治療轉移性或晚期結直腸癌的一線和二線藥物。奧沙利鉑與順鉑類似，通過與DNA形成DNA加合物從而抑制DNA的合成。此外，與順鉑不同，它也能抑制RNA的合成［3］。然而，單獨用藥時，其臨床療效相對較低，是由于其藥代動力學特性導致，如高度不可逆地結合到血漿蛋白和組織蛋白以及紅細胞［4］。此外，它具有劑量限制性副作用，如外周感覺神經病變和血小板減少癥［5］。因此，為克服以上缺點，可以利用載體將奧沙利鉑包裹，制備成奧沙利鉑脂質體以減少臨床使用的副作用。

脂質體是早期納米級別的藥物遞送系統之一，通過改變小分子抗癌藥物的組織分布，從而增加其在實體瘤部位的蓄積，提高腫瘤靶向性［6］。脂質體已被多次證明能夠提高各種藥物的治療指數。此外，將聚乙二醇（PEG）－衍生化磷脂接入脂質體膜，可以通過防止脂質體與生物體內環境的相互作用而實現長循環效應［7］，并增強脂質體到實體瘤的外滲作用，這一現象稱為EPR效應（Enhanced Permeability and Retention Effect）。對于大分子和脂質類分子，包括脂質體［8］而言，都具有上述特點。本研究的目的是使用Taguchi正交法（TOA）優化得到mPEG－修飾的奧沙利鉑脂質體的最佳處方工藝，同時還研究了不同因素對奧沙利鉑脂質體包封率的影響。此外，考察了經過mPEG－修飾的奧沙利鉑脂質體和未修飾脂質體的體外釋放行為的差異。

1 材料

奧沙利鉑（購自上海浩然生物技術有限公司）；磷脂酰膽堿（PC），膽固醇（Chol），1，2－二硬脂酰－sn－甘油－3磷酸乙醇胺－N－［順丁烯二酰亞胺（聚乙二醇）－2000］（DSPE－PEG2000）（購自AVT制藥有限公司，中國上海）；TritonX－100（阿拉丁，中國上海）；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 奧沙利鉑脂質體的制備 Szoka等［9］采用逆向蒸發法（REV）制備得到奧沙利鉑脂質體（PC／CHOL）和經mPEG2000－DSPE修飾的奧沙利鉑脂質體，即按照一定的摩爾比將脂質溶解于氯仿／乙醚的混合液中，然后向該脂質溶液中逐滴加入奧沙利鉑的9%蔗糖溶液（W／V）10 mL，使其形成W／O乳液。水相和有機相的體積比為1∶3，采用探頭式超聲儀（南京先歐儀器制造有限公司，20100071）將乳液超聲一定時間后，于40℃減壓旋蒸1 h，即得奧沙利鉑脂質體。將制得的產物分別通過0.8、0.45和 0.22μm聚碳酸酯濾膜，得到大小均勻的脂質體。

2.2 試驗設計 使用Taguchi正交表L9（34）（TOA），對所選因素進行篩選，得到制備高包封率L－OHP脂質體的最佳處方工藝。藥物與脂質的比例（W／W），膽固醇和磷脂酰膽堿的比例（M／M），氯仿與乙醚的比例（V／V），以及超聲時間，4者作為影響OHP包封率最重要的因素加以考察。這4個影響因素分別在3個水平下進行研究，如表1所示。通過L9（34）設計的9組實驗中每組試驗重復3次（表2）。使用Design Expert Version 8.0.6軟件設計試驗并評估設計的試驗。采用方差分析（ANOVA）檢測試驗模型是否具有顯著性差異。

表1 因素水平L9（34）TOA試驗設計

表2 L9（34）TOA試驗結果

2.3 粒徑和Zeta電位 使用Zeta Plus粒子分析儀（Brookhaven Instruments Corporation，美國），利用動態光散射測定粒徑和多分散系數（PDI）（25℃）。Zeta電位使用Zetasizer（Brookhaven，美國）測定。每個結果重復測定3次。

2.4 奧沙利鉑HPLC分析 使用HPLC法測定奧沙利鉑的濃度。試驗采用Dionex 3000 Ultimate（泵：LPG－3400SD，檢測器：VWD－3100，工作站：Chromeleon 6.8 SR11 Build 3161）。流動相為水－甲醇（95∶5，V／V），流速為1 mL·min－1。色譜柱為Inertsil ODSC18（4.6 mm×250 mm，5μm），檢測波長為250 nm，柱溫30℃，進樣量20μL，檢測時間15 min。奧沙利鉑的標準曲線在5～100μg·m－1范圍內呈線性，r＝0.999 7。

2.5 包封率 包封率利用改進的超濾法進行測定［10］。使用9%蔗糖溶液（W／V）將脂質體稀釋十倍，取200μL奧沙利鉑脂質體混懸液，加入超濾管（截留分子量10 000）。在4℃下，以13 000 rpm離心20 min，將游離奧沙利鉑從脂質體中分離出。收集濾液，利用上述的HPLC法檢測游離藥物的濃度。另取奧沙利鉑脂質體混懸液，加入10%Triton X－100破壞脂質體，釋放包封的奧沙利鉑，用HPLC法測定奧沙利鉑的總濃度。并對該方法進行回收率實驗驗證。將3種不同濃度的游離奧沙利鉑溶液分別與空白脂質體混合。將混合物振搖10 min后，超濾。收集超濾液，測得奧沙利鉑的濃度。回收率結果應在90%～110%的標準范圍內。

Cout表示脂質體混懸液中未包封的藥物濃度；Ctot表示脂質體混懸液中藥物的總濃度。所有試驗重復測3次。

2.6 體外釋放 使用透析法在9%蔗糖溶液中測奧沙利鉑脂質體的體外釋放曲線。將1 mL脂質體置于透析袋內（截留分子量14 000），將透析袋密封后，完全浸入50 mL釋放介質中，于37℃水浴中振搖（轉速100 rpm）。于預設時間點15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h，分別從介質中取出1 mL溶液，并補充1 mL釋放介質。采用HPLC法測定并計算脂質體中奧沙利鉑的釋放量。以L－OHP在9%的蔗糖溶液中的釋放作為對照，計算得到累積釋放度。

2.7 透射電子顯微鏡（TEM） 修飾和未修飾DSPE－PEG2000的脂質體通過透射電鏡（TEM）（日立7650型電子顯微鏡，日本東京）掃描（加速電壓為80 kV）。脂質體用蒸餾水稀釋，滴至銅網表面，用濾紙除去過量的樣品后，自然揮干。以2%磷鎢酸水溶液進行負染，室溫下放置，待干燥后進行觀察。

3 結果

3.1 試驗設計和分析 Taguchi正交法最大的特點在于，可以利用最少的試驗達到預設的優化目的［11］。在本研究中，4因素3水平的研究正是采用了該方法。對方差R進行分析，以選擇各因素水平的最佳組合。計算得到的每一水平的平均值Kn見表2。對包封率的不同影響因素中，按照影響力大小排列，分別是：藥物與脂質的比例（W／W），膽固醇和磷脂酰膽堿的比例（M／M），超聲時間以及氯仿／乙醚的體積比。使用Design Expert version 8.0.6對TOA進行方差分析。如表3所示，方差分析的結果表明，該模型有顯著性差異（P＜0.05），其中藥物與脂質的比例（A），膽固醇和磷脂酰膽堿的比例（B）和超聲時間（D）具有統計學意義的顯著差異（P＜0.05）。

表3 TOA的方差分析

3.2 不同因素對于包封率和優化配方的影響 如圖1所示，各因素各水平對于包封率的影響。膽固醇和磷脂酰膽堿的比例（B）增加，包封率增加，在1水平（1∶2）的時候達到最大值。此外，減少奧沙利鉑的用量，包封率降低，1水平達到最大值。超聲時間同樣影響藥物包封，1水平（5 min）為最優結果。分析方差結果可知，溶劑比的影響較小（P＞0.05）。4個因素的優化結果為A1B1C3D1。因此，優化的制備條件為：脂質和藥物的重量比1∶20，膽固醇和磷脂酰膽堿的摩爾比為1∶2，超聲時間5 min，氯仿／乙醚體積比為1∶3。優化后的L－OHP脂質體物理化學性質見表4。

表4 優化L－OHP脂質體理化性質

3.3 L－OHP脂質體的理化特性 L－OHP的包封率為25.4%±1.5%，PEG修飾的脂質體包封率為23.46%±1.7%。然而，與未修飾的脂質體相比，mPEG修飾的脂質體PDI更低，二者有顯著性差異（P＜0.05）。實驗表明PEG修飾后的脂質體具有較小的粒徑分布，脂質體的粒徑更加均一。PEG修飾的脂質體Zeta電位小于未修飾脂質體，說明DSPE－PEG2000一定程度上增大了膜的穩定性。利用TEM觀察不同脂質體的形態。如圖2所示，L－OHP脂質體具有球形結構，內部空間更大。而經過DSPE－PEG2000修飾的脂質體，可以觀察到在脂質體外層有白色mPEG修飾層，證明脂質體修飾成功。

圖1 奧沙利鉑脂質體影響因素實驗

圖2 優化的未修飾L－OHP脂質體TEM圖譜（a）；優化的mPEG修飾L－OHP脂質體TEM圖譜（b）；未修飾L－OHP脂質體與mPEG修飾的L－OHP脂質體在9%蔗糖溶液中的體外釋放曲線（c）

3.4 體外釋放 采用優化工藝制備得到的奧沙利鉑脂質體在9%蔗糖溶液中的體外釋放曲線見圖2c。在9%葡萄糖溶液中，L－OHP溶液在2 h內釋放可達94%，未經修飾的脂質體釋放達到80%，而經過PEG修飾的脂質體在2 h內釋放約為62%。在經過前2 h的突釋過程后，L－OHP趨于穩定釋放。分別將釋放結果帶入零級模型，一級模型和Huguchi模型進行擬合。比較擬合的相關系數，其中一級釋放模型（r＝0.990 2）為藥物從脂質體中釋放的最佳釋放模型。

4 討論

奧沙利鉑（L－OHP）是第三代鉑類似物，與前幾代相比，如順鉑和卡鉑，奧沙利鉑具有更好的活性和安全性。然而，其臨床療效在體內受到了劑量依賴神經毒性和對血紅蛋白的高分區的限制［4］。因此，需要利用藥物傳遞系統以減少其毒副作用，提高治療指數。理想的奧沙利鉑藥物傳遞系統，應具有一定選擇性的傳遞，以及通過提高藥物在腫瘤組織的滲透和滯留效應（EPR效應）從而實現藥物在腫瘤組織的蓄積和被動靶向［12］。然而，奧沙利鉑良好的水溶性和低親脂性使得藥物難以被載入脂質體內［13］。而且脂質體包封率和粒徑分布的均一性對制備方法具有較高依賴［14］。在本研究中，基于大多數文獻有關鉑及其衍生物相關載體的報道，選擇使用REV方法制備奧沙利鉑脂質體并實現被動靶向。之所以選擇這種方法，是由于其對水溶性藥物的包封率較高，可達50%［9］。針對血液循環中的穩定性問題，可通過將穩定劑接入脂質雙分子層加以克服。為了減小網狀內皮系統（RES）對脂質體的吞噬，引入了PEG化脂質（DSPE－PEG2000），實現在血液中的長循環效應。據報道，REV方法的包封率受多種因素影響，包括PC與膽固醇的比例，藥物與脂質的比例，油相與水相比例，超聲時間等［15］。在這項研究中，通過正交實驗設計確定了最佳制備工藝。優化后，mPEG修飾的脂質體平均粒徑減小到約200 nm，包封率提高至25%。此結果與之前報道的，使用REV方法得到奧沙利鉑脂質體的結果基本一致。報道同時指出，使用磷脂，可提高脂質體穩定性。Abu－Lila等［16］使用半合成脂質體（HSPC）制備了奧沙利鉑脂質體，粒徑為200 nm，包封率為20%，他們使用的半合成脂質體比天然脂質體更穩定。此外，可以通過不同的方法除去游離的奧沙利鉑，如：5%葡萄糖透析法［16］，超速離心或超濾法［14］等。本文中，使用超濾法分離游離藥物，藥物加入到空白脂質體后，在超濾液可以回收99.17%的游離藥物。TOA（表1）結果顯示，藥物與脂質的比例是影響包封率（K1平均值）的最重要因素。如圖1所示，增加藥物與脂質的比例可以增加包封率。這可能是由于藥物濃度在水相中增加，意味著藥物分子被載入脂質體的幾率增大，從而達到更高的包封率。然而，增加不成比例的藥量，當該比率升高到1∶10，包封率略有下降（數據未顯示）。膽固醇的作用同樣重要，膽固醇量的增加，包封率也會隨之增加。加入膽固醇可以增加脂質體雙分子層的剛性，因此，可以減少藥物的泄漏［17］。超聲時間也可以影響包封率。據報道，超聲時間過長可誘導藥物從脂質體中泄漏［18］。本研究中，5 min的超聲時間即可達到最高包封率。但即使延長超聲時間，若膽固醇的量控制得當，同樣可以減少藥物滲漏。此外，奧沙利鉑從PEG修飾的脂質體中釋放速度慢于從未修飾脂質體中的釋放。這一現象可能是由于PC的低相轉變溫度（約20℃）導致了脂質體膜的高流動性，從而誘發奧沙利鉑從未修飾脂質體中的快速釋放。DSPE－PEG2000修飾的脂質體膜可使藥物在生理條件下具有更好的穩定性和體內釋放行為。此外，PEG2000修飾的脂質體具有更小的粒徑，可以降低脂質體粒子間的聚集。TEM表征結果表明，脂質體具有完整的球形形態，可以較好的包載藥物與脂質體內部。

5 結論

在本研究中，采用逆向蒸發法制得了未修飾的長循環奧沙利鉑脂質體。采用Taguchi正交設計法深入研究了影響奧沙利鉑脂質體包封率的多種因素，并確定了最優處方工藝。優化工藝制備的經mPEG2000修飾的奧沙利鉑脂質體在生理條件下更加穩定，與未修飾脂質體相比，具有更好的穩定性且具有緩釋特性。因此，經過優化的PEG修飾的長循環奧沙利鉑脂質體，是一種較好的抗腫瘤藥物遞送系統。

［1］Des Guetz G，Lecaille C，Mariani P，et al.Prognostic impact of microsatellite instability in colorectal cancer patients treated with adjuvant FOLFOX［J］.Anticancer Res，2010，30（10）：4297－4301.

［2］Tampellini M.Pharmacoeconomic aspects of FOLFIRI or FOLFOX regimens administered with a fully ambulatory pump compared to the day hospital setting［J］.Tumori，2010，96（3）：438－442.

［3］Tashir T，Kawada Y，SakuraI Y，et al.Antitumor activity of a new platinum complex，oxalato（trans－l－1，2－diaminocyclohexane）platinum（II）：new experimental data［J］.Biomed Pharmacother，1989，43（4）：251－260.

［4］Pendyala L，Creaven PJ.In vitro cytotoxicity，protein binding，red blood cell partitioning，and biotransformation of oxaliplatin［J］.Cancer Res，1993，53（24）：5970－5976.

［5］Extra JM，Espie M，Calvo F，et al.Phase I study of oxaliplatin in patients with advanced cancer［J］.Cancer Chemother Pharmacol，1990，25（4）：299－303.

［6］Hussain S，Pluckthun A，Allen TM，et al.Antitumor activity of an epithelial cell adhesion molecule targeted nanovesicular drug delivery system［J］.Mol Cancer Ther，2007，6（11）：3019－3027.

［7］Allen TM，Hansen C，Martin F，et al.Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly（ethylene glycol）show prolonged circulation half－lives in vivo［J］.Biochim Biophys Acta，1991，1066（1）：29－36.

［8］Ishida O，Maruyama K，Sasaki K，et al.Size－dependent extravasation and interstitial localization of polyethyleneglycol liposomes in solid tumor－bearing mice［J］.Int J Pharm，1999，190（1）：49－56.

［9］Szoka F Jr，Papahadjopoulos D.Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse－phase evaporation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1978，75（9）：4194－4198.

［10］Ishii F，Nagasaka Y.Simple and convenientmethod for estimation marker entrapped in liposomes［J］.JDispersion Sci Technol，2001，22（1）：97－101.

［11］Ghambarian M，Yamini Y，Saleh A，et al.Taguchi OA16 orthogonal array design for the optimization of cloud point extraction for selenium determination in environmental and biological samples by tungsten－modified tube electrothermal atomic absorption spectrometry［J］.Talanta，2009，78（3）：970－976.

［12］Abu Lila AS，Doi Y，Nakamura K，etal.Sequential administration with oxaliplatin－containing PEG－coated cationic liposomes promotes a significant delivery of subsequent dose into murine solid tumor［J］.J Control Release，2010，142（2）：167－173

［13］van Zutphen S，Reedijk J.Targeting platinum antitumour drugs：Overview of strategies employed to reduce systemic toxicity［J］.Coord Chem Rev，2005，249（24）：2845－2853.

［14］Zalba S，Navarro I，Trocóniz IF，et al.Application of differentmethods to formulate PEG－liposomes of oxaliplatin：evaluation in vitro and in vivo［J］.Eur JPharm Biopharm，2012，81（2）：273－280.

［15］Kulkarni SB，Betageri GV，Singh M.Factors affectingmicroencapsulation of drugs in liposomes［J］.JMicroencapsul，1995，12（3）：229－246.

［16］Abu－Lila AS，Suzuki T，Doi Y，et al.Oxaliplatin targeting to angiogenic vessels by PEGylated cationic liposomes suppresses the angiogenesis in a dorsal air sac mouse model［J］.JControl Release，2009，134（1）：18－25.

［17］Castaing M，Loiseau A，Djoudi L.Effects of cholesterol on dye leakage induced by multidrug－resistancemodulators from anionic liposomes［J］.Eur J Pharm Sci，2003，18（1）：81－88.

［18］Taha EI，El－AnaziMH，El－Bagory IM，et al.Design of liposomal colloidal systems for ocular delivery of ciprofloxacin［OL／J］.Saudi Pharm J，2013.http：／／dx.doi.org／10.1016／j.jsps.2013.07.003.

Optim ization of oxalip latin long circulated liposom es by Taguchi orthogonal design

Cheraga Nihad，SHEN Yan，TU Jia-sheng
（State Key Laboratory of Natural Medicines，Department of Pharmaceutics，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

ObjectiveTo optimize the preparation parameters of oxaliplatin long circulated liposomes for enhancing maximum entrapment efficiency（EE%）exerting sustained－release property.MethodsTaguchiorthogonal arrays L9（34）（TOA）was applied in this investigation with encapsulation efficiency as an evaluation index.The entrapmentefficiency was calculated using Ultra－filtration techniques.The particle size，zeta potential and in vitro release behavior of L－OHP liposomeswere characterized.ResultsThe drug to lipids ratio（W／W），the cholesterol to phosphatidylcholine ratio（M／M）and the sonication time were found to be the most influencing factors（P＜0.05）.Moreover，the optimized L－OHPmPEG－modified liposome showed better physicochemical characteristics compared to the optimized L－OHP bare liposomeswith a smaller particle size of204 nm and higher entrapment efficiency up to 25.4%.TEM visualization revealed spherical structure with a large internal space and a white coated film surrounding themPEG－modified liposomes.The in vitro release of L－OHP from mPEG－modified liposome was found to be slower than that of bare liposomes and L－OHP solution，respectively.The release profile of both liposomes and solution were well described by first ordermodelwith a coefficient correlation of0.990 2.ConclusionThe optimized L－OHP long circulated liposomes using TOA designmay be a promising carrier for L－OHP delivery into tumors compared to the conventional bare liposome.

Taguchiorthogonal array；mPEG－modified liposome；Bare liposome；Oxaliplatin；Drug delivery system

R979.1

A

2095－5375（2014）04－0187－006

國家自然科學基金（No.81201182）；中央高校基本科研業務費專項基金（No.JKPZ2013006）

Cheraga Nihad，女，研究方向：藥物新劑型與新技術，E－mail：missritchi＠hotmail.com

涂家生，男，教授，研究方向：藥物新劑型與新技術，Tel：025－83271305，E－mail：jiashengtu＠cpu.edu.cn