水稻茉莉素受體基因OsCOI1a的克隆與功能研究

歐陽詩柳，任春梅

（湖南農業大學生物科學技術學院，長沙410128）

水稻茉莉素受體基因OsCOI1a的克隆與功能研究

歐陽詩柳，任春梅*

（湖南農業大學生物科學技術學院，長沙410128）

將擬南芥茉莉素受體基因COI1在水稻中的同源基因OsCOI1a構建到植物雙元表達載體pMYC2，導入擬南芥茉莉素受體突變體coi1-1中，采用Western blot檢測OsCOI1a基因的蛋白表達水平，通過觀察突變體花粉的活性和果莢的育性，檢測OsCOI1a對coi1-1突變體的互補情況，研究OsCOI1a基因的功能。結果表明，OsCOI1a基因能夠在擬南芥coi1-1突變體中正確表達，并能部分互補雄性不育的表型，表明OsCOI1a基因在水稻茉莉素信號通路中可能起茉莉素受體作用。

水稻；茉莉素；OsCOI1a基因；克隆

茉莉素（Jasmonates，JAs）［1］是來自于亞麻酸的一種新型植物激素，廣泛分布于植物界中［2］。茉莉酸（Jasmonic acid，JA）及其衍生化合物統稱為茉莉素。

有研究表明，茉莉素可以促進果實成熟和營養器官的形成，影響花粉發育、控制植物的育性、促進葉片衰老和降低植物光合作用，同時它還作為信號分子參與植物的抗性反應［3］；誘導大量防衛基因的表達，誘導植物揮發物的改變，釋放出與植物遭受植食性昆蟲侵害后相似的揮發物［4］；吸引植食性昆蟲的天敵，參與植物的間接防御從而提高植物的抗性［5］。

在茉莉素信號通路中，coronatine insensitive 1（COI1）蛋白作為茉莉素受體起著重要作用［6］，COI1的無功能突變體coi1-1喪失了對茉莉素的所有反應，表現為雄性不育［7］。COI1是一種F-box蛋白，能夠與Skpl和Cullin1蛋白形成泛素連接酶復合體Skp1／Cullin1／F-box protein COI1（SCFCOI1）［8］。

水稻基因組中存在3個COI1的同源基因Os-COI1a、OsCOI1b、OsCOI1c。2006年，OsCOI1基因第1次在水稻中被分離出來［9］（NCBI數據庫中登記為AY168645，即OsCOI1a）。研究發現，水稻OsCOI1s基因與擬南芥中COI1基因序列有55%的相似度，而OsCOI1s基因之間則有更高的序列相似度，其中OsCOI1a和OsCOI1b的相似度高達82%［10］。在水稻中還鑒定出687種潛在的F-box蛋白［11］，根據它們的構成結構域，歸納入10個亞基中，其中F-box蛋白OsCOI1a（Os01g63420）和OsCOI1b（Os05g37690）與擬南芥中COI1表現出非常相近的直系同源關系，氨基酸序列的相似度約為75%，OsCOI1a與OsCOI1b的相似度高達89%。因此，推測OsCOI1a和OsCOI1b在水稻中有與COI1在擬南芥中相似的功能，即作為茉莉素受體。

鑒于獲得水稻多突變體的周期較長，并且未見具有明顯表型的單突變體的報道，為了得到遺傳上更有力的證據，筆者將OsCOI1a構建到植物雙元表達載體pMYC2，導入擬南芥茉莉素受體突變體coi1-1，研究水稻OsCOI1a基因的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為擬南芥coi1-1雜合突變體；Os-COI1a的CDS序列通過PCR技術從野生型水稻日本晴的cDNA擴增得到；植物雙元載體pMYC2，大腸桿菌E.coli DH5α和農桿菌GV3101，均為湖南省作物基因工程重點實驗室植物信號傳導研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 pMYC-OsCOI1a重組質粒的構建

以野生型水稻日本晴的cDNA為模板，用Fast-Pfu高保真DNA聚合酶和特異性引物p1（5′-TCCCCCGGGATGGGTGGCGAGGTGCCG-3′）和p2（5′-GGAGCTCTCACGC AGGATGCAAGGGGAT-3′），對OsCOI1a的CDS序列進行PCR擴增，切下目標DNA片段后進行回收。同時從pMYC2質粒的E.coli DH5α中提取質粒，分別用Sma I和Sac I雙酶切回收。

用T4連接酶將酶切純化后的OsCOI1a基因和pMYC2連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，進行測序分析，確認質粒中帶有的OsCOI1a基因沒有發生突變以及連接邊界準確無誤。

1.2.2 pMYC-OsCOI1a重組質粒轉入農桿菌篩選轉基因植株

將重組質粒pMYC-OsCOI1a用電擊法轉入農桿菌GV3101感受態細胞中，采取抗生素Kan、Rif篩選，挑選單克隆，于LB液體培養基中培養。抽提質粒用PCR進行驗證。

擬南芥生長至抽薹后剪去主莖，再生長2個星期使其分化出多個分枝，開花后進行農桿菌的遺傳轉化。

挑取驗證正確的單克隆接種于5 mL含50μg／m L Kan、50μg／mL Rif的LB液體培養基中，振蕩培養18～24 h。然后大量培養400 m L菌液，收集菌體，用適量的農桿菌懸浮液重懸菌體，使OD600在0.8～1.0。

將花缽倒置在裝有轉化菌液的燒杯上，使擬南芥花序浸泡在轉化菌液中1～2 min；將擬南芥植株平臥在黑暗處保濕1 d，在正常培養條件下生長，1個月后收獲成熟種子。

將上述步驟中成熟種子鋪在含50μg／mL Kan的MS培養基上，篩選出綠色的幼苗。移栽至土壤中，待植物長出蓮座葉后，摘取嫩綠葉片提取DNA。

1.2.3 擬南芥coi1-1背景的鑒定

通過PCR能擴增到OsCOI1a基因片段的植株為轉化成功的植株，再將這些植株的DNA引物p1（5′-GGTTCTCTTTAGTCT TTAC-3′）和引物p2（5′-CAGACAACTA TTTCGTTACC-3′）PCR擴增后得到1.5 kb的片段，用Xcm I對PCR產物進行酶切來鑒定轉基因植株的coi1-1背景。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR和酶切結果。

1.2.4 OsCOI1a轉基因植株蛋白水平的檢測

稱取0.1 g新鮮材料，提取植物總蛋白。通過Western blot檢測OsCOI1a蛋白的表達水平，SDSPAGE電泳完畢后，將蛋白從膠上轉移到PVDF膜上，分別加入一抗Anti-MYC antibody 1∶1 000雜交液，加入二抗HRPConjugated Goat Anti-Mouse IgG 1∶1 000雜交液雜交。采用凝膠成像儀進行化學發光檢測蛋白條帶。

1.2.5 OsCOI1a轉基因植株花粉活性和果莢育性的檢測

取1 mL花粉萌發培養基均勻鋪在載玻片上。培養基凝固后，取新鮮花朵，將雄蕊在培養基上涂抹，置于25℃恒溫箱中培養8～12 h，在體式顯微鏡下觀察花粉萌發情況。

觀察coi1-1背景下OsCOI1a轉基因植株在開花后角果的伸長結果情況，判斷是否可育，從而推測OsCOI1a對擬南芥coi1-1的互補情況。

2 結果與分析

2.1 pMYC-OsCOI1a融合表達載體的構建

連接產物轉化大腸桿菌后，篩選陽性克隆進行PCR鑒定，結果表明，能夠擴增到約2 000 bp的DNA片段，與OsCOI1a的CDS序列大小（1 893 bp）相近。測序結果經序列比對分析表明與目的序列完全一致，說明成功構建了pMYC-OsCOI1a融合表達載體。

2.2 轉基因植物的鑒定結果

采用農桿菌介導法，將OsCOI1a轉入擬南芥突變體coi1-1雜合體中，在含Kan抗生素的培養基上篩選。提取抗性植株的DNA，先用PCR從抗性植株中擴增OsCOI1a基因片段驗證轉基因植株（圖1 -A），結果表明能夠擴增到約2 000 bp的DNA片段，與OsCOI1a的CDS序列大小（1 893 bp）相近。用引物p1和p2 PCR擴增后得到1.5 kb的片段，用Xcm I對擬南芥DNA的PCR產物進行酶切，圖1-B中1.5 kb的片段中包含了COI1和coi1-1突變體部分的等位基因。在野生型中，Xcm I酶可以識別CCA-9N-TGG片段并切開產生2個片段，但在coi1-1突變體中，Xcm I酶切位點突變，不能切成2個片段。

電泳結果顯示：6個單株不能被Xcm I酶切，依舊為1.5 kb的條帶（圖1-B）；而野生型背景的可以被Xcm I酶切，產生1.0 kb和0.5 kb的2個條帶。

2.3 轉基因植物蛋白水平的檢測結果

OsCOI1a蛋白的相對分子質量大約為7.0× 103，加上pMYC2載體上與OsCOI1a融合表達的6 ×MYC tag以及銜接序列，理論相對分子質量約為8.0×103，而實際表觀相對分子質量約為9.5×104。Western blot檢測結果（圖2）顯示，在相對分子質量為9.5×104處有明顯的蛋白條帶，而陰性對照在相應位置沒有任何條帶，說明OsCOI1a在轉基因植株中得到了表達。

圖2OsCOI1a蛋白表達水平表達

2.4 轉基因植物花粉活性的檢測結果

對coi1-1純合背景下的OsCOI1a轉基因植株的花粉活性進行檢測，發現野生型Col-0擬南芥的花絲能夠正常伸長，花藥可以正常開裂，花粉也能正常萌發；擬南芥coi1-1純合突變體花絲不能正常伸長，花藥不能正常開裂，花粉基本不萌發。coi1-1雜合背景下的OsCOI1a轉基因植株表型與野生型Col-0一致；而在coi1-1純合背景下的OsCOI1a轉基因植株中，有的與擬南芥coi1-1純合突變體的表型相同，例如OsCOI1a-2，有的與野生型Col-0的表型接近，如OsCOI1a-30（圖3）。

圖3 轉基因植物花粉活性的檢測

2.5 OsCOI1a基因可部分互補擬南芥coi1-1

觀察coi1-1純合背景下的OsCOI1a轉基因植株的育性，發現OsCOI1a-30植株在生長后期產生了部分可育的果莢（圖4），說明OsCOI1a基因可部分互補擬南芥coi1-1突變體雄性不育的表型。

圖4 轉基因植物的表型

3 討論

在水稻中，茉莉酸信號傳導介導了不同的細胞反應，而COI1s在這條響應途徑中也是重要的元件之一，有3個非常相近的COI1同源體。在筆者的研究中，OsCOI1a的CDS序列大小為1 893 bp，通過與擬南芥突變體coi1-1的互補試驗證明了水稻中的這些COI1同源體其中的OsCOI1a在JA信號傳導通路中的功能，還包括恢復了受損的JA信號響應如部分育性。對由35S啟動子重組OsCOI1a在coi1-1中完成了超表達，JA信號傳導和育性被恢復。結果顯示OsCOI1a的同源體與COI1是直系同源。

通過對轉基因擬南芥進行PCR檢測，表明Os-COI1a基因轉入了擬南芥coi1-1。用Xcm I對轉基因植株DNA的PCR產物進行酶切，鑒定出coi1-1純合背景下的轉基因OsCOI1a植株。通過生化試驗證明了OsCOI1a基因表達出目的蛋白。獲得的6株coi1-1純合背景下的OsCOI1a轉基因植株，其中有1株的花粉活性檢測出有活性，最終也產生了部分可育的果莢。說明OsCOI1a能部分互補擬南芥coi1-1的表型，與擬南芥COI1具有類似的功能，在水稻中作為茉莉素的受體起重要作用。

另外幾株coi1-1純合背景的OsCOI1a轉基因植株沒有產生果莢，可能是由于內含子偏愛或者其他原因造成，需要進一步研究。

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Cloning and Function of the Rice Jasmonate Receptor Gene OsCOI1a

OUYANGShi-liu，RENChun-mei*

（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

We cloned OsCOI1a into the expression vector pMYC2，and transformed it into Arabidopsiscoi1-1mutants.We tested the protein expression levels bywestern blot，observed the activity of pollen and the sterility of siliques in coi1-1 mutants transformed with OsCOI1a，and found out that OsCOI1a could partly complement the phenotype of the sterility of Arabidopsis coi1-1mutants.All these results suggested that OsCOI1a might be a receptor of jasmonates in rice.

Rice；Jasmonate receptor；Gene OsCOI1a；Cloning

Q785

A

1001-5280（2014）04-0337-04 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.04.01

2014 03 05

歐陽詩柳（1987-），女，廣東深圳人，碩士研究生，Email：oyshiliu＠qq.com。*通信作者：任春梅，教授，Email：rencm66＠163.com。

國家自然科學基金項目（30770195）。