一株降解咪草煙陰溝腸桿菌的分離與鑒定

牛彥波，吳皓瓊，殷 博，曹亞彬，安 琦

(1.黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱150020;2.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱150010)

化學除草是現代農業不可分割的一部分，咪草煙(又名咪唑乙煙酸)為大豆田常用的長效廣譜化學除草劑，由于其除草效果好、殺草譜廣、用藥量少、使用方便、用藥成本低，被廣泛應用。雖然因其對后茬作物有較強的藥害，被限制使用，但仍不能禁止。前茬大豆田施用咪唑乙煙酸的地塊，后茬一年內不得改種玉米、小麥、大麥、煙草;一年半內不得改種棉花、向日葵，兩年內不得改種水稻、高梁和谷子;三年內不得改種油菜、馬鈴薯、瓜類和蔬菜;四年內不得改種甜菜、亞麻［1］。研究發現:在不同的土壤中咪草煙的半衰期不同，在偏堿性的土壤中咪草煙的降解速率較快，在酸性、有機質豐富的土壤中咪草煙的降解速率緩慢，其在土壤中的降解主要依賴微生物作用［2，3］。因此篩選獲得高降解活性的咪草煙降解菌尤為重要，本研究從被咪草煙污染的大豆田土壤分離篩選咪草煙降解菌，獲得一株編號為T04細菌，咪草煙的最高降解率達到99.2%，經生化鑒定與分子鑒定，該菌株為陰溝腸桿菌復合菌(Enterobacter cloacaecomplex)。在目前的文獻中還未發現該屬菌株對咪草煙的降解特性，故本研究的發現豐富了咪草煙降解菌范疇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤

采自黑龍江省訥河市被咪草煙污染的大豆田土壤。

1.1.2 藥品

10%咪草煙水溶劑為市售，咪草煙原藥為98.5%的純度，其他化學藥品均為分析純。

1.1.3 培養基配方

無機鹽培養基:K2HPO40.1 g、CaCO30.04 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、(NH4)2SO40.1g、H2O 1000 mL，pH 7.0 ～7.2。

LB 培養基:牛肉膏 3.0 g 、蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g、H2O 1000 mL，pH 7.0 ～7.2。

若制成固體培養基需在上述培養基中加入18.0 g瓊脂粉。滅菌溫度為121℃，20 min。咪草煙的添加量依實驗的具體要求。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

初篩:將土樣經過風干、粉碎、過篩處理后，稱取5.0 g土樣加入到以咪草煙為唯一碳源和能源的100 mL無機鹽培養基中，該無機鹽培養基中加入10%的咪草煙水劑3 mL，培養溫度30℃，轉數160 r/min經過5～7 d的液體搖床培養。

復篩:將10 mL初篩培養物在復篩培養基中經過連續2次的連續復篩培養，每次均增加無機鹽培養基中咪草煙的含量，咪草煙的添加量依次為5 mL、10 mL。

菌株分離純化:用1 mL無菌吸管吸取1 mL最后一次復篩的培養物，加入到9 mL無菌水中進行10倍稀釋，用1 mL無菌吸管吸取0.1 mL各梯度稀釋液，加入每百毫升含10%咪草煙0.5 mL的固體無機鹽培養平板中，用玻璃刮扒涂勻，在30℃的恒溫培養箱中培養，1～3 d后觀察。挑取生長快的菌落進行劃線分離培養，直至獲得單菌落為止。

菌株功能驗證:將分離得到的單菌落分別再轉入每百毫升含10%咪草煙0.5 mL的無機鹽培養基中和LB培養基中培養，觀察菌株在培養液中的生長情況，并測定發酵液的菌密度OD600值，將生長迅速、菌密度高的培養物再進行劃線分離反復純化與培養，獲得穩定的目標菌株。

1.2.2 T04 菌株的鑒定

菌株生化鑒定采用梅里埃VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統，利用 GN板測試。菌株16SrDNA序列測定委托寶生物工程(大連)有限公司進行，結果在NCBI進行比對。結合菌體形態特征、革蘭氏染色等，參照《伯杰細菌鑒定手冊》第8版，及《常見細菌系統鑒定手冊》最終確定種屬關系。

1.2.3 T04 菌株降解能力

菌株在不同培養基上的降解能力比對:用無菌接種環挑取1環T04的斜面純培養物，分別接入每百毫升含純度為98.5%咪草煙0.3 g的無機鹽培養液中和每百毫升含純度為98.5%咪草煙0.5 g的LB培養基中，在30℃、150 r/min振蕩培養2～3 d后，采用液相色譜測定發酵液中的咪草煙殘留量［4］，以不加菌的各培養液為CK對照，計算咪草煙的降解率。

菌株在不同咪草煙濃度中的降解:用無菌接種環挑取1環T04的斜面純培養物，分別接入每百毫升含10%咪草煙0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL 的 LB 培養液中，每個3次重復，在30℃、150 r/min振蕩培養2～3 d后，采用液相色譜測定發酵液中的咪草煙殘留量。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

經過高濃度液體富集培養方法，從平板中初步分離得到6株細菌，經過驗證試驗(菌株篩選驗證結果見表1)，其中編號T02、T04、T06的3株菌在以咪草煙為唯一碳源和能源的無機鹽培養基中，經振蕩培養4～5 d均可良好生長，說明此3株菌都能夠單一利用咪草煙，進行菌體的繁殖，而其他3株菌在咪草煙的利用方面，表現力弱。在添加了咪草煙的LB培養基中6株菌均能良好生長，但T02、T04、T06的菌密度仍高于其余3株菌，其中T04在2種培養基中的菌密度都最高，說明菌株T04對咪草煙的利用更好，并且菌株的繁殖力更強。故而對T04菌株做進一步的測試工作。

表1 菌株在含咪草煙的不同培養基中的生長情況Tab.1 The growth of strains in different media containing imazethapyr

2.2 T04 菌株鑒定

T04菌株在無機鹽培養基上生長緩慢，而在營養豐富的LB培養基上生長迅速，菌落微黃，扁平，表面濕潤，邊緣整齊，在20×100倍光學顯微鏡下觀察，菌體為短桿狀、無芽孢、G－，無莢膜。生理生化試驗顯示明膠液化緩慢，賴氨酸不脫羧，有精氨酸雙水解酶，甘油或肌醇發酵不產氣，可利用丙二酸鹽作為碳源。結合菌株16SrDNA測序結果，在NCBI上進行比對，繪制T04菌株的系統進化樹，確定T04菌株為陰溝腸桿菌復合菌(Enterobacter cloacae complex)。具體生化反應結果見表2。菌株16SrRNA序列見圖2，菌體照片見圖1。

表2 T04菌株在GN生化板上的反應結果Tab.2 The biochemical reaction results of T04 strain in GN

圖2 T04菌株在NCBI上的系統進化樹Fig.2 The blast tree of T04 based on NCBI

2.3 菌株降解能力

通過表3和表4表明，在無機鹽培養基中T04菌株對咪草煙的降解率比對照(不接菌的培養基)在相同的時間里高51.8%，而在LB培養基中高94.1%，菌株T04在含量超過0.2 mL10%咪草煙LB培養基中的降解率較高，最高達到99.2%，在含0.1 mL10%咪草煙的培養基中的菌株對咪草煙的降解率只有24.5%，這可能是因為發酵液中的咪草煙含量低，不足以對菌株的代謝途徑加以調節，且培養基中的營養物質足以維持菌株繁殖所致，而在添加量超過0.2時菌株的代謝受到咪草煙的調控，可能是咪草煙的添加使菌株的代謝方式有所改變，菌株的活性得到提高，說明適量的咪草煙添加對菌株的生長有利;同時發現菌株的菌密度高，菌株的降解率也高，說明菌株的降解活性高低與菌株的生長密不可分，呈正相關性;并且LB發酵液中豐富的營養不僅對菌株的生長有利，同時也提高了菌株的降解活性。

表3 T04在不同培養基上降解咪草煙效率Tab.3 The imazethapyr degradation efficiency of T04 strain in the different media

表4 在咪草煙不同濃度水平下的降解效率Tab.4 Degradation of imazethapyr at different concentration levels

3 結論

通過咪草煙高濃度、梯度富集培養的方法從咪草煙污染土壤中分離得到6株可利用咪草煙繁殖的細菌，其中3株菌的咪草煙降解能力較穩定，由于T04繁殖力最強，故而對其進行了鑒定，綜合分析后確定菌株T04為陰溝腸桿菌復合菌(Enterobacter cloacae complex)。采用液相色譜對咪草煙殘留量進行分析后發現，在不同的養分環境中，菌株對咪草煙的降解能力差別較明顯，菌株雖可營自養生長，但更適宜異養生活，咪草煙適宜的添加量對菌株的活力有影響，至于影響的深度需要做進一步的研究。這樣的發現也使得菌株的田間應用有了理論的基礎，因為咪草煙在有機質豐富的土壤中難以降解［3］，而該菌株的異樣生活方式，使得菌株具有了未來應用的空間。

［1］ 常秋紅，黃巧云.大豆田除草劑使用品種及化除技術［J］.上海農業科技，2013，(06):139—141.

［2］ 黃安太，車軍.咪草煙在不同土壤和水體中的殘留動態研究［J］.安徽農業科學，2007，35(33):10769—10770.

［3］ 李宏園，陶波.除草劑咪唑乙煙酸在土壤中的歸趨［C］∥長春:雜草科學與環境及糧食安全.2004:416—420.

［4］ 周艷明，張寒松.反相高效液相色譜法檢測大豆中咪草煙［J］.食品科學，2010，31(08):237—240.