血液制品病毒滅活/去除方法概述

遲妍妍，王 斐，張 惠，臧恒昌

(1.山東大學藥學院，山東 濟南 250012;2.山東泰邦生物制品有限公司，山東 泰安 271000;3.北京凱元盛世科技發展有限責任公司，山東 濟南 250012)

血液制品［1］是指各種人血漿蛋白制品，包括人血白蛋白、靜脈注射用人免疫球蛋白、人凝血因子、人凝血酶原復合物等，是臨床上廣泛使用的一類重要的生物制品。血液制品原料是人類血漿，而目前已知經血液制品傳染的病毒［2］主要有人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、巨細胞病毒(CMV)、人體T細胞白血病病毒(HTLV)和細小病毒B19等。為保證血液制品安全性，主要采取三個有效措施［2，3］:①對獻血者的精密篩選，確保血源的安全性;②對每人份血液/血漿進行病毒的系統檢測;③生產過程中進行的有效的病毒滅活/去除。因此，為提高血液制品安全性，病毒滅活/去除方法［4］的選擇具有重要意義。

1 化學法

1.1 有機溶劑/表面活性劑(S/D)法 早在20世紀80年代中期S/D法開始發展應用，目前依然是血液制品中一種核心的病毒滅活方法。此方法的基本原理是:有機溶劑和非離子表面活性劑的混合物能夠破壞脂包膜病毒的類脂膜，從而使類脂從病毒表面脫落，使病毒失去黏附和感染細胞的能力。Roberts［5］對S/D法用于高純度的凝血因子進行病毒滅活的有效性進行了詳盡的考察。結果顯示，以0.3%的TNBP和1%的Triton－X100為S/D試劑，在22℃條件下處理30min后可以對凝血因子制品中的牛痘病毒、單純皰疹病毒、辛德畢斯病毒等模擬脂包膜病毒進行有效的滅活，證實了S/D法用于脂包膜病毒滅活的穩健性和有效性。S/D法主要用于凝血因子制品、蛋白酶抑制劑、人免疫球蛋白等血液制品的脂包膜病毒的滅活。

1.2 低pH孵放法 低pH孵放在20世紀80年代初用于注射用人免疫球蛋白的制備過程中防止免疫球蛋白的聚合，隨后發現其對大部分的脂包膜病毒有滅活作用，后被用于血液制品的病毒滅活。滅活機理是:在pH 4，溫度30～37℃條件下保溫超過20 h，某些病毒成分產生變質，從而影響病毒的復制，最終使病毒失去傳染性。Roberts等［6］對孵放法進行了考察，研究表明，在pH 5、30℃條件下對靜脈注射用免疫球蛋白持續處理14 d能夠對脂包膜病毒和部分非包膜病毒進行有效的滅活。證實了該方法可以作為生產過程的終端處理，和S/D法、離子交換層析法結合共同用于注射用免疫球蛋白的病毒滅活，保證免疫球蛋白產品的安全性。該方法要求蛋白質產品的活性在低pH條件下保持穩定，因此一般只用于免疫球蛋白脂包膜病毒的滅活。

1.3 辛酸處理法 早在20世紀90年代初，Lundblad等［7］報道了辛酸鈉滅活4種脂包膜蛋白的機制，揭開了辛酸法在病毒滅活中的應用。此法是在低pH條件下，辛酸的非離子形式具有親脂性，能夠進入病毒脂包膜從而破壞脂質雙分子層和相關蛋白質的完整性，使脂包膜病毒失去傳染性，達到脂包膜病毒的滅活作用。Dichtelmüller等［8］以3批注射用免疫球蛋白制劑作為研究對象，對辛酸法用于免疫球蛋白溶液病毒滅活的有效性進行了考察。結果顯示，7.45 g·kg－1的辛酸溶液能夠在極短的時間(1min)內對人免疫缺陷病毒、牛病毒性腹瀉病毒、辛德畢斯病毒、偽狂犬病病毒進行有效的滅活。由于辛酸法需要在低pH(通常pH＜6)條件下發揮作用，要求蛋白質產品在低pH條件下能夠保持其穩定性，因此目前主要用于免疫球蛋白M和免疫球蛋白G的病毒滅活。

1.4 光化學法 亞甲藍(MB)/可見光處理法、補骨脂素/UVA處理法、核黃素/UV處理法等是目前常用的光化學方法［9］，主要用于全血漿以及血小板制品的病毒滅活。

MB/可見光法病毒滅活的原理［10］是:MB是一種帶正電荷的感光吩噻嗪染劑，可以穿過病毒的包膜與核酸結合，在一定強度的光照射下發生光化學反應，產生羥基自由基和單態氧，阻止核酸的復制從而達到病毒滅活的目的。此法對脂包膜病毒有良好的滅活效果，對非包膜病毒滅活效果不理想。此外，對于不穩定的蛋白產品可能造成功能活性的損失，目前多有文獻報道［11］此病毒滅活方法對于血漿蛋白的影響變化。

補骨脂素/UVA法病毒滅活的原理［12］是:補骨脂素分子能夠可逆的嵌入DNA、RNA螺旋中，在長波紫外線(UVB)的照射下，補骨脂素分子與嘧啶堿基相互作用，阻止病毒的復制，使其失去傳染性。此方法的病毒滅活效果以及缺陷與MB/可見光法相似。

核黃素/UV法的原理［13］是:核黃素是小分子物質，能夠插入核酸內部，在UV的作用下，通過可逆性氧化還原反應轉移電子，使鳥嘌呤氧化，病毒無法復制從而使其失去傳染性。此法對脂包膜病毒以及一些非包膜病毒的滅活作用效果顯著，但是也容易造成不穩定蛋白的失活。

2 物理法

2.1 巴氏消毒法 巴氏消毒法是在60℃條件下對蛋白質溶液進行連續加熱至少10 h，使病毒蛋白變性，從而抑制病毒遺傳物質的復制，最終使病毒失去傳染性。Chandra等［14］通過相關文獻的檢索對巴氏消毒法進行了詳細的綜述，結果表明巴氏消毒法只需要控制很少的過程參數，滅毒過程容易被監測，對脂包膜病毒和非包膜病毒均有滅活作用，滅毒范圍廣。作為一種傳統成熟的病毒滅活方法，巴氏消毒法可以用于白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、蛋白酶抑制劑等血液制品的脂包膜和非包膜病毒的滅活。雖然巴氏消毒法目前已成為一種廣泛的血液制品病毒滅活方法，但同時存在著一些局限性:①蛋白質穩定劑的加入降低了病毒滅活的能力;②細小病毒B19有耐熱性，不利于該病毒的滅活;③在熱條件處理下會導致蛋白質產品的變性，使產品的活性降低，因此不能用于穩定性不好的血漿蛋白的病毒滅活。

2.2 干熱處理法 干熱法最早于20世紀80年代初被用于凝血因子制品中肝炎病毒的滅活，1984年，干熱法被批準用于HIV的滅活。其原理是:制劑凍干后加熱處理，使病毒復制所需要的分子和結構改變，從而抑制其復制過程。干熱法常用的處理條件有60℃、96 h，80℃、72 h以及100℃、30min。Seop等［15］通過對凍干后的凝血因子進行干熱法病毒滅活的研究發現，在100℃、30min的處理條件下，此病毒滅活方法除了對豬細小病毒的滅活不理想外，對其他病毒均有良好的滅活效果，而且經過此方法后凝血因子的失活僅在5%左右，沒有發現蛋白制品的物理或生物學性質發生變化，證明了干熱法作為最終病毒滅活的關鍵步驟，能夠保證凝血因子產品的病毒安全性。由于對病毒滅活能力的限制，此方法常用于凝血因子制品的輔助病毒滅活方法。

3 病毒去除方法

3.1 納米膜過濾［4］納米膜過濾病毒去除技術是使用15～45 nm之間的濾膜對血液制品溶液進行過濾，利用篩分原理，在納米膜過濾中，大于濾膜孔徑的病毒或其他病原體被截留在薄膜上，尺寸較小的蛋白產品則能通過濾膜繼續存留在溶液中。繼20世紀90年代初中期被引進用于病毒去除以來，納米膜過濾技術已經發展成為一種廣為接受的穩定可靠的病毒去除方法，并且用于除了白蛋白制品之外的其他血液制品的病毒去除過程。Caballero等［16］考察了巴氏消毒法結合納米膜過濾去除病毒的有效性，以豬細小病毒作為模擬病毒，結果發現通過孔徑為20 nm的納米濾膜后病毒滴度下降＞4log，證實了納米膜過濾結合巴氏消毒法和S/D法用于一種新的免疫球蛋白制品病毒去除的有效性。納米膜過濾法能夠有效去除非包膜病毒以及其他難以滅活的致病病原體，提高了目標蛋白產品的安全性，并且蛋白生物活性回收率能夠達到90%～95%。

3.2 其他方法 蛋白產品的制備過程中常包含有沉淀步驟，同時也有病毒去除的作用。在冷乙醇沉淀過程中，各種病毒可能被分離至廢棄組分中，蛋白純化的同時進行部分病毒的移除。深度過濾是一種重要的蛋白純化手段，濾材會對部分病毒產生吸附，從而去除病毒。層析技術是目前迅速發展的一種蛋白純化方法，在純化過程中蛋白產品被吸附在層析柱而病毒存在于流動相中，在蛋白純化的同時進行病毒的去除。Roberts等［6］經研究發現，靜脈注射用免疫球蛋白產品經離子交換層析過程后，1型單純皰疹病毒和牛乳頭狀瘤病毒的滴度下降＞5log，能夠對病毒有效的去除，對其他模擬病毒雖有一定的去除作用，但是不能達到有效的移除。

以上冷乙醇沉淀、深度過濾、層析等都是蛋白產品的生產過程，同時也具有病毒移除的作用。但是這些過程對病毒的移除能力有限，因此只能作為一種輔助的手段。

4 結語

綜上所述，目前化學法中的S/D法、低pH孵放法、辛酸法、光化學法，物理法中的巴氏消毒法和干熱法等是血液制品制備過程中核心的病毒滅活方法。此外，納米膜過濾、冷乙醇沉淀過程、深度過濾、層析法等方法雖然不能保證去除所有的病毒，但是和核心的病毒滅活方法相結合，共同保證病毒的徹底滅活/去除，保證血液制品的安全性。如今，血液制品安全性的保證是主要目的，而病毒的有效滅活/去除的環節至關重要。由于單一病毒滅活/去除方式的局限性，存在對有些病毒(尤其是非包膜病毒)不能完全的去除的可能性，因此目前生產過程中一般采用兩種或兩種以上的病毒滅活/去除方法以保證血液制品的安全性。為更好地達到病毒滅活/去除的目的，更有效、安全的方式也在不斷研究與開發中，不同方式的有機結合也將是新的發展方向。

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