Fat－1轉基因小鼠的研究進展

高 翔，李文德

(廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東醫學院，廣東 湛江 524023)

多不飽和脂肪酸(PUFAs)為人體必需脂肪酸，具有很重要的生理功能。其中與人體健康密切相關的PUFAs主要是n－3和n－6 PUFAs。攝入高水平的n－3 PUFAs伴有較低的n－6 PUFAs可以促進嬰幼兒視網膜、大腦和神經系統的發育;降低人體心血管疾病和炎癥的發生，還可以抑制體外培養的乳腺癌、肺癌、前列腺癌和結腸癌細胞［1～4］的增生，促進腫瘤細胞的凋亡。這提示n－6/n－3 PUFAs的比例對于維持細胞穩態和正常生長起著關鍵的作用。世界衛生組織建議，人體內正常細胞的細胞膜和細胞器n－6/n－3 PUFAs理想比例應該在1∶1到4∶1。隨著社會的發展，大量的加工和養殖產品的出現，人類食用非野生動植物過量導致體內的脂肪酸比例嚴重的失去平衡。大部分人體內n－6/n－3 PUFAs比例可能達到10～15∶1［5］。導致這種現象的原因主要是哺乳動物生物體內缺乏合成n－3 PUFAs前體的酶，也缺乏將n－6 PUFAs轉化為n－3 PUFAs的酶，使得n－6/n－3 PUFAs比例失調。大量的流行病學資料顯示，飲食中的n－6/n－3 PUFAs比例過高，特別是n－3 PUFAs的缺乏，會導致機體功能障礙，引發一系列的疾病的發生(如心腦血管疾病、癌癥、精神性疾病等)。為了更好地研究n－6/n－3 PUFAs比例對這類疾病的防治作用和相關機制，建立一個能排除飲食等混雜因素的干擾，并有良好的對照動物模型是非常必要的。而fat－1轉基因小鼠模型的出現為研究者們提供了一個很好無干擾性因素的實驗工具。

1 Fat－1轉基因小鼠

2004年美國哈佛大學麻省總醫院的康景軒博士實驗室培育出一種能將n－6 PUFAs轉化為n－3 PUFAs的轉基因小鼠［6］，此小鼠攜帶來源于線蟲(C.elegans)并表達n－3脂肪酸去飽和酶的fat－1基因，為了能在小鼠體內中表達的來自線蟲(C.elegans)異源性的n－3脂肪酸去飽和酶，Kang等［7］優化了編碼該蛋白質的fat－1基因的密碼子并將其耦合到一個雞的β－肌動蛋白啟動子中。然后，通過顯微注射方法將表達的載體導入受精卵，產生表達fat－1基因的轉基因小鼠，因此，即使在缺少富含n－3的飲食的條件下，小鼠自身也可以將體內n－6 PUFAs轉化為n－3 PUFAs，從而使動物的組織和器官中富含n－3 PUFAs，并且組織中的n－6/n－3 PUFAs比例趨于均衡。因此，fat－1轉基因小鼠是一個研究n－3 PUFAs的生物學功能和探討n－6/n－3 PUFAs比例在各種疾病中的作用的重要動物模型。

當fat－1轉基因小鼠和同窩野生型小鼠都喂養含有高的n－6 PUFAs(主要是亞油酸，18∶2)和極低的 n－3 PUFAs(約占總脂肪的0.1%)的飲食一段時間后，兩種小鼠體內的脂肪酸分布極不相同。野生型小鼠組織和器官內含有的多不飽和脂肪酸絕大多數為n－6PUFAs的亞油酸(LA，18∶2 n－6)和花生四烯酸(AA，20∶4 n－6)，幾乎不含 n －3 PUFAs，與野生型小鼠比，fat－1轉基因小鼠體內的n－3 PUFAs含量明顯提高，其中主要包含亞麻酸(ALA，18∶3 n－3)、二十碳五烯酸(EPA，20∶5 n －3)、二十二碳五烯酸(DPA，22∶5 n－3)和二十二碳六烯酸(DHA，22∶6 n－3)，同時 n－6 PUFAs中LA和AA的含量下降，但組織的總的脂肪酸的含量不變，這表明fat－1轉基因小鼠可以將體內的n－6 PUFAs轉化為n－3 PUFAs，從而使它們的比值從20～50下降到約為1。這種情況可在小鼠的肌肉、母乳、血紅細胞、心臟、腦、肝臟、腎臟、肺、脾臟等組織和器官中都可被檢測出。另外研究還發現fat－1轉基因小鼠不但非常健康，而且在繁育數代之后，它們后代小鼠的組織和器官內n－3 PUFAs高含量的現象仍然得以保留，這就表明轉入的fat－1基因具有良好的遺傳性和較高的生物學活性［7］。

2 Fat－1轉基因小鼠的優勢

與飲食補充的方法相比較，fat－1轉基因動物模型的方法在改變組織中n－6/n－3 PUFAs比例方面有獨特的優勢。它不僅可以增加n－3 PUFAs的含量，而且還可以明顯減低n－6 PUFAs的水平，從而更有效的使n－6/n－3 PUFAs比例趨于均衡，而不改變總體的脂肪酸的含量(如fat－1轉基因小鼠和同窩野生型小鼠組織中n－3和n－6 PUFAs總量保持不變，但其比例已發生改變)。因此，fat－1轉基因小鼠模型是改變組織中n－6/n－3 PUFAs比例的理想方法。

另外，使用fat－1小鼠模型可以減少因長期喂養(2～3月或更長)不同飼料所帶來的麻煩，節省時間與金錢。在fat－1轉基因小鼠體內，脂肪酸成分的改變(將n－6 PUFAs轉化為n－3 PUFAs)發生早在胚胎階段，并持續于小鼠整個壽命階段。因此，fat－1轉基因小鼠提供了一個方便的模型，用以研究在不同的年齡或時間點 n－3 PUFAs的生物學作用。

此外，fat－1轉基因小鼠可以和現有疾病模型小鼠(轉基因或基因敲除小鼠，如ob/ob肥胖模型，apoE－/－動脈粥樣硬化模型，)進行交配，所產生的子代可用于研究n－3 PUFAs或不同n－6/n－3 PUFAs比例對疾病發生發展過程的影響。

3 Fat－1轉基因鼠模型的研究現狀

3.1 對神經系統的作用 神經系統中富含n－3 PUFAs，尤其是二十二碳六烯酸(DHA)。DHA是人的大腦發育、成長的重要物質之一，是神經系統細胞生長及維持的一種主要元素。它在人體大腦皮層中約占磷脂脂肪酸的40%，在神經組織中約占脂肪含量的25%。作為腦中的主要脂肪酸成分，DHA可以影響神經細胞的各種結構和功能。因此研究n－3 PUFAs對神經系統性疾病的保護機制有重要的意義。

最近利用fat－1轉基因小鼠的研究表明，增加腦部的DHA可以顯著增加神經細胞增殖數量，并且通過增加海馬CA1區錐體神經元樹突棘密度使海馬區的軸突數量增多。與此同時，在Morris水迷宮測試中，與同窩野生型小鼠相比，fat－1小鼠表現出更好的空間學習能力。在體外實驗進一步證明DHA可促進小鼠胚胎干細胞的增殖能力和神經分化能力。這些結果提供了直接的證據，表明DHA能促進神經發生和軸突形成并對神經細胞具有保護作用［8］。另外，Lebbadi等［9］還研究了n－3 PUFAs對阿爾茨海默病的防治作用。研究者將純合子(ho)的三轉基因阿爾茨海默病小鼠(3×Tg－AD)和雜合子(he)的fat－1轉基因小鼠雜交，結果顯示在20月齡時，對比3×Tg－AD小鼠，3×Tg－AD/fat－1小鼠腦內n－6/n－3 PUFAs比值增加了10%，DHA增加了6%。fat－1基因的表達也使3×Tg－AD/fat－1小鼠腦內的可溶性Aβ42減少41%，可溶性磷酸化tau蛋白下降25%，非可溶性磷酸化tau蛋白下降55%，反應星形膠質細胞活性的膠質纖維酸性蛋白(GFAP)減少37%。這些結果表明增加腦內的n－6/n－3 PUFAs比例和DHA可改善AD樣的神經病理學病變。同樣，在慢性的中樞神經系統退行性疾病帕金森綜合征的研究中，Bousquet等［10］發現，fat－1轉基因小鼠雖不足已對抗1－甲基 －4－苯基 －1，2，3，6－四氫吡啶(MPTP)所造成的神經損傷，但是腦皮質的較高的DHA與黑質中的多巴胺能神經元呈正相關，不僅能增加酪氨酸羥化酶(TH)的陽性數量，也能增加多巴胺轉運蛋白(DAT)和黑質的孤兒核受體(Nurr1)mRNA的表達。這足以證明DHA對帕金森的保護作用。因此，提示n－3 PUFAs是有益于阿爾茨海默病，帕金森病的預防和治療。

3.2 對心血管系統的作用 心血管疾病是一種嚴重威脅人類，特別是50歲以上中老年健康的常見病。全世界每年死于心血管疾病的人數達到1500萬人，居各種死因的首位。目前心血管疾病已經成為危害人類健康的“頭號無聲殺手”［11］。有大量研究證實n－3 PUFAs有助于預防心血管疾病的發生，還能對某些心血管疾病(特別是動脈粥樣硬化)起到治療作用。但是，通過飲食補充n－3PUFAs來研究其對心血管疾病(特別是動脈粥樣硬化)的影響，存在著一定干擾因素。因此，Wan等人［12］將模擬動脈粥樣硬化apoE－/－模型小鼠和 fat－1轉基因小鼠雜交培育出apoE－/－/fat－1 雙轉基因小鼠。相比較 apoE－/－小鼠，雙轉基因小鼠主動脈病變面積顯著性地降低了6.32%。但是，除血清中較高的甘油三酯外，雙轉基因小鼠血清中的膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的水平與apoE－/－小鼠沒有顯著性差異。進一步發現，雙轉基因小鼠體內前列腺素E2(PGE2)、細胞間粘附分子－1、單核細胞趨化蛋白 －1、白細胞介6(IL－6)和環氧合酶－2(COX－2)表達減少。這表明體內高含量的n－3 PUFAs有抗動脈粥樣硬化的作用，其作用機制可能與其抗炎作用密切相關。

3.3 抗癌作用 研究發現，在腫瘤細胞中n－6/n－3 PUFAs的比值遠遠高于正常水平。體內n－6/n－3 PUFAs比例的失調，會導致乳腺癌、結腸癌、肝癌等癌癥發生。目前研究者對于fat－1基因抗腫瘤的作用有了初步的認識，但是其抗腫瘤的機制現還不是很清楚。為了探討n－6/n－3 PUFAs比例與腫瘤發生之間的關系，Xia等［13］將小鼠黑色素瘤B16細胞植入fat－1轉基因小鼠和同窩野生型小鼠(wt)體內，觀察兩種小鼠的腫瘤的形成和成長速率，與wt小鼠相比，fat－1小鼠體內黑色素瘤形成和發展都顯著減慢，而且腫瘤和周邊的組織中均含有較高的n－3 PUFAs及其代謝產物PGE3，此外，腫瘤抑制因子PTEN基因也顯著上調。體外細胞培養發現，n－3 PUFAs的抗腫瘤機制可能是通過增加PGE3來激活PTEN通路。另一方面的研究發現，結腸組織的n－3 PUFAs能有效的預防結腸腫瘤的發生。Nowak等［14］在用炎癥物質(葡聚糖硫酸鈉)和致癌物質(氧化偶氮甲烷)誘導結腸腫瘤發生的過程中，發現fat－1轉基因小鼠的結腸腫瘤的發生和生長率都有所下降，并伴有活性較低的NF－kB、iNOS和較高水平的 TGF－β。Jia等［15］還發現，n－3 PUFAs可降低CD3+T細胞，CD4+T輔助細胞和腸道內巨噬細胞的數量，這表明n－3 PUFAs可通過降低炎癥來抑制結腸癌的發生。為了確定n－6/n－3 PUFAs比例對前列腺癌的影響，Berquin等［16］將fat－1小鼠和前列腺特異性Pten基因敲除小鼠(一種前列腺癌模型)雜交培育出Pten基因敲除+fat－1雙轉基因小鼠，發現相對Pten基因敲除小鼠，雙轉基因小鼠可顯著性的降低腫瘤生長率和增加小鼠的存活率，而且還可減少磷酸化的細胞凋亡因子Bad的比例。同樣，在fat－1小鼠中觀察到，n－3 PUFAs可以促進乳腺的分化來降低乳腺癌的發生的風險［17］。還有研究發現，DHA能上調配體蛋白聚糖－1(SDC－1)來抑制MEK/Erk/Bad信號通路從而誘導乳腺癌細胞的凋亡［18］。

3.4 抗骨質疏松作用 骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨組織顯微結構退化為特征，以致骨的脆性增高及骨折危險性增加的一種全身骨病。OP多發于老年人群，與其相關的骨折是導致死亡或喪失活動能力的主要原因［19］。個體骨量是由飲食、身體活動、遺傳因素等共同決定的。近年越來越多的研究提示飲食因素中PUFA對骨骼健康有重要的影響。其中研究報道n－3 PUFAs有防治骨丟失中的作用。

Rahman等［20］研究喂養含10%半純化AIN－93M飲食后的fat－1轉基因小鼠、野生型小鼠、去卵巢fat－1轉基因小鼠及去卵巢野生小鼠之間骨密度的差異，發現，與去卵巢的wt小鼠比較，去卵巢fat－1轉基因小鼠可降低NF－kB配體受體激活因子(RANKL)和血清中的堿性磷酸酶，增加股骨遠端，脛骨近端，股骨中段的骨密度。體外實驗顯示，去卵巢的wt小鼠，去卵巢fat－1轉基因小鼠的骨髓細胞在LPS刺激下，后者體內的促炎因子 TNF－α、IL－1β、IL－6顯著降低，而抗炎因子IL－10、干擾素－2、NO顯著提高，并且降低了環氧化酶－2和NF－kB的活性。這提示omega－6/omega－3的低比例可產生抗炎作用來防治去卵巢小鼠骨密度的丟失。隨后，Banu等［21］也研究了 n－3 PUFAs對去卵巢小鼠的骨質影響情況，發現野生型小鼠在去卵巢手術后，在股骨末梢、股骨頸、近端脛骨及第四腰椎有顯著骨質丟失;而去卵巢的fat－1小鼠在上述部位沒有觀察到明顯的骨質丟失。這表明，n－3 PUFAs可以減輕去卵巢術誘導的多個部位骨質丟失，其中最主要的是減少骨內皮質表面的骨吸收。

4 展望

n－3 PUFAs具有抗炎，緩解動脈粥樣硬化等抗心血管疾病，抑制腫瘤的發生和癌細胞的生長繁殖和遷移的作用;還與人類多種神經性疾病有關，可改善阿爾茨海默病和帕金森綜合征的癥狀;此外還能預防骨質疏松癥的骨量的丟失。鑒于n－3 PUFAs對多種疾病均有防御和治療作用，更深入的研究其與疾病之間的作用機制顯得更為重要。而fat－1轉基因小鼠模型在研究過程中有著不可替代的先天優勢，該模型小鼠以及它與其他基因改造的各種疾病模型小鼠雜交的后代，將為進一步揭示n－3 PUFAs的藥理作用及其分子機制提供重要基礎平臺。fat－1小鼠必將更廣泛地應用到PUFAs與疾病關系的研究中。

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