FGFR2異構體及相關剪接因子在人胚胎干細胞和成體干細胞中的表達

傅 歆，谷聰敏，嚴 笠，肖 苒

（中國醫學科學院整形外科醫院研究中心，北京 100144）

根據發育的不同階段，干細胞可以分為胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）和成體干細胞（adult stem cells，ASCs）兩大類。體外懸浮培養的人ESCs可模擬體內早期胚胎發育過程，分化形成含有三胚層來源細胞的擬胚體（embryoid Bodies，EBs）。中胚層來源的骨髓間充質干細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）和脂肪間充質干細胞（adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs）以及外胚層來源的毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）均屬于 ASCs。來源于不同發育階段和不同組織器官的干細胞在基因表達調控、表觀遺傳狀態、體外增殖和分化潛能等方面都存在很大的差異［1］。成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2）有兩個異構體Ⅲb和Ⅲc，它們在生物體個體發育過程發揮重要的調控作用。FGFR2Ⅲb與皮膚的發育有關，其缺失對小鼠具有致死性［2］;FGFR2Ⅲc的缺失會引起骨骼發育異常［3］。現階段，FGFR2異構體在胚胎發育不同階段的干細胞中的表達水平尚不明確。本實驗比較了人H9 ESCs及其分化的EBs，以及BMSCs、ADSCs和HFSCs中FGFR2異構體及其相關選擇性剪接因子的表達。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細胞

高糖DMEM、PBS和雙抗（HyClone公司）;H9 ESC和HFSC細胞培養相關試劑（Gibco和StemCell公司）;Matrigel（BD公司）;如無特殊說明，化學藥品（Sigma公司）;引物合成（北京賽百盛公司）;RTPCR和Real-time PCR試劑（Invitrogen和Roche公司）;一抗 OCT4（sc-8629）、CK15（sc-56520）、P63（sc-25268）、CD29（sc-13590）（Santa Cruz公司）;一抗 SSEA-4（560073）、Tra-1-60（560071）、StemflowTM人MSC分析試劑盒（BD公司）;二抗（A21203和A11001）（Invitrogen公司）。

H9 ESC（WiCell公司）（同意書編號:11-W0039）。ADSC來源于接受抽脂術的健康人（青年女性）脂肪組織。BMSC來源于健康志愿者（青年男性）髂骨骨髓。HFSC來源于美容除皺術切下的正常人帶毛發頭皮（均知情同意）。

1.2 H9 ESC的培養和EB分化

H9 ESC在Matrigel上的培養及EB分化方法見參考文獻［4］。

1.3 免疫熒光染色

細胞經甲醛固定后破膜液（0.2%Tween-20/PBS）37℃處理15 min，一抗4℃過夜，二抗室溫避光3 h，Dapi染細胞核1 min，熒光顯微鏡采集圖像。……