響應(yīng)面法優(yōu)化微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積培養(yǎng)基

竹文坤，牟濤，段濤，張友魁，羅學(xué)剛

（1 西南科技大學(xué)中國工程物理研究院激光聚變研究中心極端條件物質(zhì)特性聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽 621000；2 中國工程物理研究院，四川 綿陽 621000）

自然界中的成巖微生物通過其自身的生命活動(dòng)，與周圍環(huán)境介質(zhì)之間不斷發(fā)生酶化作用，逐漸礦化形成膠結(jié)物質(zhì)CaCO3。微生物成巖作用需經(jīng)歷漫長地質(zhì)時(shí)期的累積，最終將自然界中的疏松的巖石碎屑膠結(jié)成堅(jiān)硬的巖石[1-5]。受此自然現(xiàn)象啟發(fā)，可利用成巖細(xì)菌——碳酸鹽礦化菌，提供其適宜的生長、培養(yǎng)和活化反應(yīng)條件，加速其酶化作用，沉積出CaCO3，在較短時(shí)間內(nèi)將石質(zhì)材料膠結(jié)起來。這項(xiàng)技術(shù)環(huán)境友好，可廣泛應(yīng)用于建筑物和古跡裂縫的修復(fù)[4-5]、沙土的加固[6]、水泥基材料改性[7-9]、土壤重金屬降解[10-11]等領(lǐng)域。該技術(shù)利用某些特定細(xì)菌自身代謝活動(dòng)，與周圍環(huán)境介質(zhì)之間不斷發(fā)生酶化作用，分解尿素，使溶液中的 CO濃度不斷增加。菌體細(xì)胞膜界面處帶負(fù)電荷的水可溶有機(jī)質(zhì)中不斷螯合Ca2+，誘導(dǎo)出局部的晶體陰離子（CO）濃度進(jìn)一步增大，從而吸引更多的Ca2+，直到晶體前驅(qū)物濃度增大到利于核化，沉積出CaCO3顆粒。但是，微生物沉淀 CaCO3過程中，沉淀的 CaCO3晶型、形貌、沉淀量和堆積密度等受營養(yǎng)條件和生長環(huán)境的影響。由于諸多因素沒有協(xié)調(diào)控制，使得微生物在沉積CaCO3時(shí)速度慢，時(shí)效差。因此，如何提高微生物沉淀CaCO3產(chǎn)率，是微生物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。國內(nèi)外對于微生物礦化機(jī)理研究多有報(bào)道[12-16]，但是對于微生物沉淀CaCO3培養(yǎng)基優(yōu)化在國內(nèi)外的文獻(xiàn)資料中，尚未見這方面詳細(xì)深入的研究報(bào)道。為此，本研究利用微生物誘導(dǎo)CaCO3的沉積，通過二次旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)，探討葡萄糖、蛋白胨、尿素、硝酸鈣、吐溫和氯化鎳等因素對CaCO3沉淀量的影響，對培養(yǎng)基的組分進(jìn)行優(yōu)化，以期提高微生物沉積CaCO3的產(chǎn)率，為微生物修復(fù)技術(shù)的時(shí)效性提供理論和實(shí)際指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

根據(jù)碳酸鹽礦化菌的酶化特征要求，選用購自美國ATCC（美國菌種保藏中心）的巴斯德芽孢桿菌（bacillus pasteurii，ATCC11859）。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂15g/L，pH值8.0。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH值8.0。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 10g/L，pH值7.0。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH值7.0。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

掃 描 電 子 顯 微 鏡 （ Scanning electron microscopic，SEM），EVO 18型，德國蔡司公司；X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD），X’Pert Pro型，荷蘭帕納科公司；同步熱分析儀（Thermal analyzer，TA），SDT Q600型，美國TA儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種制備

將巴斯德芽孢桿菌保藏菌種轉(zhuǎn)接于新鮮試管斜面，30℃培養(yǎng)24h，保存于4℃冰箱備用。從保存的斜面培養(yǎng)基中用接種環(huán)挑取 5環(huán)菌苔接種于裝有100m L液體種子培養(yǎng)基的250m L三角瓶中，30℃，150r/m in搖床培養(yǎng)24h，活菌量4.94×109cfu/m L，保存于4℃冰箱備用。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

以葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、尿素濃度、硝酸鈣濃度、吐溫濃度、氯化鎳濃度作為實(shí)驗(yàn)因素，采用6因子5水平的二次回歸旋轉(zhuǎn)組合體設(shè)計(jì)L36（65）正交表進(jìn)行沉淀?xiàng)l件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[17-19]進(jìn)行，以CaCO3的沉積量為考察指標(biāo)。配制好培養(yǎng)基，pH值調(diào)至8.0，在500m L三角瓶封裝250m L培養(yǎng)基溶液，1×105Pa滅菌30min，冷卻。用微孔過濾器加尿素和硝酸鈣，接種5%（體積分?jǐn)?shù)）的液體種子，30℃、170r/m in搖床振蕩培養(yǎng)48h，靜置24h，過濾，沉淀物用乙醇和超純水洗滌3次，置于50℃烘箱內(nèi)烘48h，稱量。正交實(shí)驗(yàn)的水平與因素的確定見表1。

1.2.3 樣品分析

SEM放大1000～10000倍觀察產(chǎn)物的形貌；利用XRD對產(chǎn)物進(jìn)行晶型分析；在40～900℃范圍內(nèi)，升溫速度為 20℃/m in 的條件下對樣品進(jìn)行熱分析。由于CaCO3的分解溫度為600～850℃，根據(jù)在該范圍內(nèi)失重的CO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，可計(jì)算沉淀樣品中CaCO3的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平與因素

按上述正交實(shí)驗(yàn)配方進(jìn)行處理，培養(yǎng)基成分對巴斯德芽孢桿菌誘導(dǎo) CaCO3沉淀量影響的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 二次回歸旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用DPSv12.01軟件對表2中的巴斯德芽孢桿菌誘導(dǎo)CaCO3沉淀量的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，可以模擬出CaCO3沉淀量與參試因子之間的二次回歸數(shù)學(xué)模型，如式（1）。

式（1）的失擬性檢驗(yàn) F1=0.46076＜F0.05(4，7)=4.12，說明模型不存在失擬因素。顯著性檢驗(yàn)F2=16.82608＞F0.01(24，7)=3.41，達(dá)到極顯著水平，說明回歸是極顯著的，此模型可信度好。F檢驗(yàn)結(jié)果表明X2、X3、X5均在0.01水平上差異顯著，說明3個(gè)因素對CaCO3沉淀量均有極顯著的影響。由式1知，X1、X3和X4起正效應(yīng)，X2、X5和X6起負(fù)效應(yīng)；X和X均起正效應(yīng)，X、X、X和X起負(fù)效應(yīng)；X1X2、X1X4、X1X5、X2X3、X3X4、X3X5、X3X6和X5X6兩因子互作后起正效應(yīng)，X1X3、X1X6、X2X5和X4X5兩因子互作后分別起負(fù)效應(yīng)。

在α=0.10的顯著水平，剔除不顯著項(xiàng)，簡化后的回歸方程見式（2）。

2.1.1 單因子效應(yīng)分析

由DPSv12.01軟件對表2中CaCO3沉淀量數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，得到影響巴斯德芽孢桿菌誘導(dǎo)CaCO3沉淀量的主因子效應(yīng)分析如圖1。由圖1可知，氯化鎳的含量對CaCO3沉淀量影響不顯著，但從成本和促進(jìn)尿素酶活性效果考慮，氯化鎳用量不宜太大。隨著培養(yǎng)基中大豆蛋白胨濃度、吐溫 80濃度的增加，CaCO3沉淀量均呈現(xiàn)下降趨勢；隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的升高，CaCO3沉淀量呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢；隨著培養(yǎng)基中尿素的增加，CaCO3沉淀量呈增加趨勢；隨著培養(yǎng)基中硝酸鈣濃度的增加，CaCO3沉淀量呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢。

2.1.2 雙因子效應(yīng)分析

由式2簡化回歸方程，可知X1X3、X1X4、X1X5、X4X5、X3X6雙因子互作效應(yīng)對CaCO3沉淀量影響極顯著。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作雙因子互作效應(yīng)圖，每個(gè)響應(yīng)面分別代表兩個(gè)因子之間的相互影響，其他變量保持在0水平，如圖2～圖6所示。

由圖2～圖6可以看到葡萄糖與尿素、葡萄糖與硝酸鈣、葡萄糖與吐溫80、硝酸鈣與吐溫80、尿素與氯化鎳兩兩交互作用的響應(yīng)面圖，可直觀看出各因子對響應(yīng)值影響的變化趨勢。從圖2中可以看出，當(dāng)葡萄糖濃度在低水平時(shí)，隨培養(yǎng)基中尿素濃度的增加，CaCO3沉積量先增加后減少；而葡萄糖濃度在高水平時(shí)，CaCO3沉積量卻隨尿素濃度的增加大幅度降低。當(dāng)尿素濃度在低水平時(shí)，隨培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增加，CaCO3沉淀量大幅度增加；而尿素濃度在高水平時(shí)，CaCO3沉淀量受葡萄糖影響較小。圖3～圖6可做類似分析。

圖1 單因子效應(yīng)分析

圖2 葡萄糖（X1）和尿素（X3）雙因子效應(yīng)圖

圖3 葡萄糖（X1）和硝酸鈣（X4）雙因子效應(yīng)圖

圖4 葡萄糖（X1）和吐溫80（X5）雙因子效應(yīng)圖

圖5 硝酸鈣（X4）和吐溫80（X5）雙因子效應(yīng)圖

圖6 尿素（X3）和氯化鎳（X6）雙因子效應(yīng)圖

根據(jù)式 2，結(jié)合單因子效應(yīng)分析和雙因子交互效應(yīng)分析，使CaCO3沉積量達(dá)到最大的X1、X2、X3、X4、X5、X6的因素組合為0、-2、2、2、-2、2，即葡萄糖30g/L、大豆蛋白胨10g/L、尿素50g/L、硝酸鈣0.5mol/L、吐溫80體積分?jǐn)?shù)0.05%、氯化鎳250μmol/L。

2.2 SEM分析

對沉淀粉末樣品的 SEM分析，結(jié)果表明，36個(gè)樣品CaCO3顆粒形貌和堆積密度基本相似，顆粒大小存在差別。沉淀粉末樣品C1和C3的SEM分析如圖7所示。由圖可知，C1和C3無規(guī)則塊狀體團(tuán)聚體，表面粗糙，分布雜亂無章，C1團(tuán)聚體較大，間隙較大，而C3團(tuán)聚體較小，間隙較小。且所有沉淀樣品表面存在 1～2μm印痕（如圖中箭頭所指），推測為菌體沖洗后遺留下來的，說明菌體參與了CaCO3晶體的形成。

2.3 XRD分析

圖7 沉淀CaCO3晶體掃描電鏡圖

對沉淀粉末樣品進(jìn)行 XRD分析，結(jié)果表明，36個(gè)CaCO3樣品晶型是方解石和球霰石混合晶型。所有樣品都出現(xiàn)方解石和球霰石特征峰，位置基本相同，但是峰的相對強(qiáng)弱發(fā)生了一些變化，即方解石和球霰石相對含量不同。沉淀粉末樣品C1和C3的XRD如圖8所示。由圖8可知，對照PDF標(biāo)準(zhǔn)卡的有關(guān)數(shù)據(jù)，沉淀粉末樣品出現(xiàn)方解石特征峰，主要衍射角 2θ=23.0°、29.4°、35.9°、39.5°、43.1°、47.5°、48.5°、58.5°，分別對應(yīng)（012）、（104）、（110）、（113）、（202）、（018）、（116）、（122）晶面。對照PDF標(biāo)準(zhǔn)卡（PDF No：00-024-0030）的有關(guān)數(shù)據(jù)，沉淀粉末樣品出現(xiàn)球霰石特征峰，主要衍射角2θ=20.9°、24.8°、27.0°、32.7°、43.8°、49.9°、55.7°，分別對應(yīng)（002）、（100）、（101）、（102）、（110）、（104）、（202）晶面。

圖8 沉淀CaCO3樣品XRD譜圖

2.4 TG/DSC分析

對沉淀粉末樣品進(jìn)行TG/DSC分析，結(jié)果表明，36個(gè)CaCO3樣品的TG/DSC曲線基本相似。沉淀粉末樣品C1進(jìn)行TG/DSC分析如圖9所示。由圖9可知，在0～200℃范圍內(nèi)，樣品TG曲線因水分熱分解脫附略呈下降趨勢，在 200～600℃有失重臺(tái)階，這是由于球形CaCO3樣品內(nèi)有機(jī)質(zhì)及殘留細(xì)菌分解的結(jié)果，失重率為5.32%；在600～800℃有一個(gè)大的失重臺(tái)階，同時(shí)在該溫度范圍內(nèi) DSC曲線上有一吸熱峰，歸屬為 CaCO3分解峰，其失重率為41.67%。

3 結(jié) 論

圖9 沉淀CaCO3樣品C1的TG/DSC譜圖

通過對微生物誘導(dǎo) CaCO3沉積培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，可知在適宜的培養(yǎng)條件下，葡萄糖、大豆蛋白胨作為營養(yǎng)物質(zhì)，在吐溫80和氯化鎳促進(jìn)作用下，尿素誘導(dǎo)產(chǎn)生大量高活性的尿素酶，尿素大量被分解形成CO，再與Ca2+作用，形成大量的CaCO3沉積。沉積CaCO3形貌呈無規(guī)則塊狀體團(tuán)聚體，表面粗糙，分布雜亂無章，粒徑在20～100μm，并含有少量有機(jī)物。晶型是方解石和球霰石混合晶型，菌體參與了CaCO3晶體的形成。為提高微生物沉積CaCO3的沉積量，錢春香等[20]對培養(yǎng)基濃度、底物濃度、細(xì)菌接種量和成核劑4個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)后引入氯化鈣，形成CaCO3沉淀。實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)后再引入鈣源，將會(huì)給野外施工帶來不便，成本也會(huì)增加。在培養(yǎng)前引入鈣源，使微生物在代謝過程中快速形成CaCO3是比較科學(xué)的工藝。所以，本實(shí)驗(yàn)研究不同配比的葡萄糖、大豆蛋白胨、氯化鎳、尿素、吐溫80、硝酸鈣等協(xié)同作用下對誘導(dǎo)碳酸高沉淀量的影響是具有實(shí)際意義的。但本實(shí)驗(yàn)主要原料是葡萄糖、大豆蛋白胨等精細(xì)原料，生產(chǎn)成本較高，使用價(jià)廉易得的農(nóng)副產(chǎn)品作為主要原料對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化、提高CaCO3沉淀量以及各培養(yǎng)成分對尿素酶產(chǎn)量及活性的影響等方面還需要深入研究。

[1] 王瑞興.碳酸鹽礦化菌研究[D].南京：東南大學(xué)，2005.

[2] 黃琰，羅學(xué)剛，杜菲，等.微生物在石英砂中誘導(dǎo)方解石沉積的實(shí)驗(yàn)研究[J].西南科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，24（2）：65-69.

[3] Bundeleva I A，Shirokova L S，Bénézeth P，et al.Calcium carbonate precipitation by anoxygenic phototrophic bacteria[J].Chemical Geology，2012，291：116-131.

[4] Gaylarde C，Silva M R，Warscheid T.M icrobial impact on building materials：An overview[J].Materials and Structures，2003，36（5）：342-352.

[5] Fernandes P.Applied microbiology and biotechnology in theconservation of stone cultural heritage materials[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2006，73（2）：291-296.

[6] M itchell J K，Santamarina J C.Biological considerations in geotechnical engineering[J].Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering，ASCE，2005，131（10）：1222-1233.

[7] 袁曉露，周世華.M ICP技術(shù)對水泥基材料的改性研究[J].混凝土，2012，3：88-90.

[8] Grabiec A M，Klama J，Zawal D，et al.Modification of recycled concrete aggregate by calcium carbonate biodeposition[J].Construction and Building Materials，2012，34：145-150.

[9] Kim H K，Park S J，Han J I，et al.M icrobially mediated calcium carbonate precipitation on normal and lightweight concrete[J].Construction and Building Materials，2013，38：1073-1082.

[10] Li Meng，Cheng Xiaohui，Guo Honxian.Heavy metal removal by biom ineralization of urease producing bacteria isolated from soil[J].International Biodeterioration and Biodegradation，2013，76：81-85.

[11] 成亮，錢春香.碳酸巖礦化菌株A固結(jié)土壤Cd2+的生物礦化過程[J].硅酸鹽學(xué)報(bào)，2008，36（s1）：215-222.

[12] De Muynck W，De Belie N，Verstraete W.Microbial carbonate precipitation in construction materials：A review[J].Ecological Engineering，2010，36（2）：118-136.

[13] 成亮，錢春香.生物礦化碳酸鈣機(jī)理研究進(jìn)展[J].硅酸鹽學(xué)報(bào)，2006，25（6）：108-115.

[14] 張剛生，謝先德.CaCO3生物礦化的研究進(jìn)展——有機(jī)質(zhì)的控制作用[J].地球科學(xué)進(jìn)展，2000，15（2）：204-209.

[15] Omelon S，Ariganello M，Bonucci E，et al.A review of phosphate mineral nucleation in biology and geobiology[J].Calcified Tissue International，2013，93（4）：382-396.

[16] Dham i N K，Reddy M S，Mukherjee A.Biom ineralization of calcium carbonates and their engineered applications：A review[J].Frontiers in Microbiology，2013，4：1-9.

[17] 何美儒，金志華，胡升，等.響應(yīng)面法優(yōu)化達(dá)托霉素發(fā)酵培養(yǎng)基[J].化工進(jìn)展，2012，31（4）：873-877.

[18] 王瑞興，錢春香，王劍云.微生物沉積碳酸鈣研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，35：191-195.

[19] 李沛豪，屈文俊.細(xì)菌誘導(dǎo)碳酸鈣礦化材料及其應(yīng)用前景[J].建筑材料學(xué)報(bào)，2009，12（4）：482-486.

[20] 錢春香，王劍云，王瑞興，等.微生物沉積方解石的產(chǎn)率[J].硅酸鹽學(xué)報(bào)，2006，34（5）：618-621.