坎地沙坦抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的VSMCs炎癥因子釋放的作用研究

于新輝，閆 超，孟 哲

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬太倉人民醫(yī)院胸外科，江蘇太倉215400；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州450003）

低度的持續(xù)性炎性反應(yīng)對動脈粥樣硬化的發(fā)展具有顯著的促進作用［1-2］。病理狀態(tài)下，血管平滑肌細胞（VSMCs）通過過度增殖及釋放包括白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在內(nèi)的多種細胞因子、趨化因子、黏附分子，促進動脈粥樣斑塊的形成和發(fā)展，誘發(fā)斑塊失穩(wěn)［3］。Toll 受體4 是最早發(fā)現(xiàn)的Toll 樣受體家族（TLRs）成員，它廣泛分布于包括巨噬細胞、內(nèi)皮細胞及VSMCs 在內(nèi)的多種具有心血管活性的細胞表面［4-5］。TLR4 在與其特異性配體LPS結(jié)合后，通過上調(diào)NF-κB（p65）等轉(zhuǎn)錄因子的表達，顯著增加IL-1β、TNF-α、單核細胞趨化因子-1（MCP-1）等多種炎性因子的釋放，從而誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)［6-7］。已有研究表明：在動脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓和2 型糖尿病等慢性炎性反應(yīng)相關(guān)性疾病的靶器官（主要為心臟、血管、腎臟）內(nèi)，TLR4 m RNA和蛋白的表達均有明顯升高［8］。坎地沙坦屬于血管緊張素Ⅱ1 型受體（AT1 受體）拮抗劑類藥物，被廣泛應(yīng)用于原發(fā)性高血壓［9］、糖尿病腎病［10］和慢性心力衰竭的臨床治療［11］。坎地沙坦已被證明能夠有效地抑制LPS 誘發(fā)的腦部及脾臟炎性反應(yīng)［12-13］，逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化病變［14］。本研究著眼于坎地沙坦對LPS 誘導(dǎo)VSMCs 炎癥因子釋放的影響及這種作用與TLR 4 介導(dǎo)的信號通路間的關(guān)系，以尋求坎地沙坦改善動脈粥樣斑塊病變的分子機制，為其用于冠心病的治療提供一定的依據(jù)。

表1 實時定量PCR引物序列

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量150～180 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2 藥品及試劑 坎地沙坦（Wako 公司，日本），DMEM高糖培養(yǎng)液（Gibco 公司，美國），胎牛血清及實時定量PCR試劑盒（TransGen 公司，北京），四甲基偶氮唑藍（MTT）、DPI、PDTC和LPS（Sigma公 司，美 國），TNF-α 和IL-1βELISA試 劑 盒（BioSource International公 司，美 國），兔 抗 大 鼠 TLR4、Myd88、NF-κB（p65）、TLR4抗 體 和β-actin（Santa Cruz 公 司，美國），DCFH-DA活性氧測定試劑（碧云天生物，北京）。

1.3 方法

1.3.1 VSMCs 原代培養(yǎng)30%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，快速分離胸主動脈，仔細剝離血管內(nèi)膜及外膜，剪碎至1～2 mm3大小組織塊，使用貼壁法培養(yǎng)。將細胞置于含200 m L／L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，其中含有100U／m L的青霉素和100μg／m L 的鏈霉素，然后放入37℃、50mL／L CO2 細胞培養(yǎng)箱中。使用相差顯微鏡和α-actin 對VSMCs 進行形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)鑒定。取第3～6 代細胞，用于后續(xù)實驗。

1.3.2 實驗分組 將VSMCs 分為5 組：A組（對照組）、B組（LPS 干預(yù)組）、C組（LPS＋10-7mo l／L坎地 沙坦）、D組（LPS＋10-6mol／L坎 地 沙 坦）和E組（LPS＋10-5mo l／L坎 地 沙坦）。以上B～E 組中LPS 的濃度均為500 ng／m L。

1.3.3 MTT比色法測定不同濃度坎地沙坦對VSMCs 活性的影響 將5 ×104個／孔VSMCs 接種于96 孔板，按照上述細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h，改用20 mL／L低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，給予坎地沙坦10-8、10-7、10-6、10-5和10-4mol／L孵 育24 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入MTT（5 g／L）20μL，37 ℃孵育4 h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜100μL，微微振蕩數(shù)次后，在全自動酶標(biāo)儀上于570 nm處測定各組吸光度值。

1.3.4 實 時 定 量PCR檢 測 各 組VSMCs TLR4和Myd88 mRNA的表達以5 ×105個／孔的密度將細胞接種于6 孔板中，坎地沙坦（10-7、10-6、10-5mol／L）預(yù)處理1 h 后，加入LPS（500 ng／m L）孵育6 h，按照說明書使用Trizol 提取各組細胞總RNA。10 g／L 的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，分光光度計在260 nm處檢測RNA的純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransGen 公司，北京）操作步驟，將各組m RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Primer7.0 軟件設(shè)計熒光定量PCR引物，由南京金絲瑞公司合成，序列如表1 所示。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共計40 個循環(huán)。使用Bio-Rad IQ5 熒光PCR儀自帶分析軟件對實時定量PCR結(jié)果進行分析。

1.3.5 DCFH-DA氧化法測定細胞內(nèi)ROS 生成 取生長狀態(tài)良好的VSMCs，以2 ×104個／孔的密度種植于96 孔板中，生長24 h 后，給予坎地沙坦（10-7、10-6、10-5mol／L）預(yù)處理1 h。棄去細胞上清液，加入25μmol／L的DCFH-DA溶液，37℃孵育1 h。仔細漂洗干凈后，再給予含有500 ng／mL LPS 高糖DMEM培養(yǎng)基刺激2 h。酶標(biāo)儀在485 nm激發(fā)波長和528 nm發(fā)射波長條件下，測定各組吸光度值。

1.3.6 Western blot 檢測各組VSMCs TLR4、Myd88 和NFκB（p65）蛋白的表達 以5 ×105個／孔的密度將細胞接種于6孔板中，10-7、10-6、10-5mol／L坎 地 沙 坦 孵 育1h后，加 入LPS（500 ng／mL）刺激9 h。每孔使用150μL RIPA裂解液提取蛋白。核蛋白使用核蛋白提取試劑盒（Pierce NE-PER kit）進行提取。BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣品蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液并煮沸后，制作10%SDS-PAGE凝膠進行電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。一抗?jié)舛葹椋篢LR4（1∶200）、Myd88（1∶500）、NF-κB（p65）（1∶200）和β-actin（1∶2000）。以βactin 作為內(nèi)參照。化學(xué)發(fā)光法檢測，采集圖像，利用Quantity one 軟件進行圖像分析。

1.3.7 ELISA測定上清液中IL-1β和TNF-α的表達 將各組VSMCs 以5 ×104個／孔的密度接種于96 孔板中，不同濃度坎地沙坦預(yù)處理1 h，再給予500 ng／m L 的LPS 刺激24 h。使用TLR4 抗體（5μg／m L）、DPI（20μmol／L）、PDTC（80μmol／L）或聯(lián)合坎地沙坦（10-5mol／L）預(yù)處理細胞1 h，再給予500 ng／mL 的LPS 刺激24 h。收集各孔內(nèi)細胞上清液，依據(jù)操作說明，使用ELISA試劑盒測定IL-1β和TNF-α的分泌。使用自動酶聯(lián)免疫吸附儀在450 nm處讀取數(shù)值，繪制IL-1β和TNF-α的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并據(jù)此計算各實驗組結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用±s表示，組間比較使用單因素方差分析，多重均數(shù)比較使用SNK檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度坎地沙坦對VSMCs 活性的影響 為了明確不同濃度坎地沙坦有無細胞毒性作用，使用MTT對不同濃度坎地沙坦干預(yù)的VSMCs 活性進行測定。結(jié)果顯示：在10-8～10-4mol／L 范圍內(nèi)，坎地沙坦對細胞活性均無明顯影響。因此，以下實驗選用10-7～10-5mol／L 這一中間濃度進行干預(yù)。

2.2 不同濃度坎地沙坦對VSMCs IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白表達的影響 見圖1，如圖1A、1B所示，500 ng／m L LPS刺激24 h 后，LPS 組細胞上清液中IL-1β和TNF-α分泌明顯增多，分別為675.15、401.26 pg／mL（P＜0.01）。給予不同濃度坎地沙坦（10-7、10-6、10-5mol／L）預(yù) 處 理1 h后，IL-1β和TNF-α分泌顯著下降，并呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）。在m RNA水平，坎地沙坦也可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β 和TNF-αmRNA表達升高（P＜0.05），見圖1C、1D。

2.3 不同濃度坎地沙坦對TLR4、Myd88 mRNA和蛋白表達的影響500 ng／m L LPS 刺激4h 后，TLR4 和Myd88 蛋白表達明顯增加（P＜0.01）。使用10-7、10-6、10-5mol／L坎地沙坦預(yù)處理1 h 后，再給予相同濃度LPS 刺激24h，與LPS 組比較，TLR4 和Myd88 蛋白表達顯著減少，并呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05），見圖2A、2B。坎地沙坦也能夠顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的TLR4 和Myd88 mRNA表達的升高，并具有濃度依賴性（P＜0.05），見圖2C、2D。

圖1 不同濃度坎地沙坦對LPS 誘導(dǎo)的VSMCs IL-1β和TNF-αm RNA和蛋白表達的影響

圖2 不同濃度坎地沙坦對VSMCs TLR4、Myd88 mRNA和蛋白表達的影響

2.4 不同濃度坎地沙坦對iROS 生成的影響 如圖3 所示，與對照組相比，LPS（500 ng／m L）顯著增加iROS 的生成（P＜0.01），使用10-7、10-6、10-5mol／L 坎地沙坦預(yù)處理1 h，能夠有效抑制LPS 誘導(dǎo)的VSMCs 內(nèi)iROS 的生成，并具有濃度依賴性（P＜0.05）。提示坎地沙坦能夠有效地抑制LPS 誘導(dǎo)的VSMCs iROS 生成。見圖3。

2.5 不同濃度坎地沙坦對NF-κB（p65）核轉(zhuǎn)位的影響NFκB 為核轉(zhuǎn)錄因子，細胞核內(nèi)的NF-κB（p65）含量可以間接反映NF-κB 的活化。500ng／mL LPS 刺激24h 后，細胞核內(nèi)NFκB（p65）的蛋白表達明顯上升（P＜0.01），而細胞質(zhì)內(nèi)NF-κB（p65）的含量則顯著降低（P＜0.01）。使用坎地沙坦（10-7、10-6、10-5mol／L）預(yù)處理1 h 后，再給予相同濃度LPS 刺激9 h，較LPS 組，NF-κB（p65）核轉(zhuǎn)位水平明顯下降，并呈現(xiàn)劑量依賴性（圖4）。結(jié)果表明坎地沙坦能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs NF-κB 活 化。

圖3 不同濃度坎地沙坦對iROS 生成的影響

圖4 不同濃度坎地沙坦對LPS-誘導(dǎo)的VSMCs NF-κB（p65）核轉(zhuǎn)位的影響

圖5 坎地沙坦通過TLR4／Myd88-iROS-NF-κB 信號通路抑制LPS 誘導(dǎo)的VSMCs IL-1β和TNF-α分泌

2.6 TLR4／Myd88-iROS-NF-κB信號通路在坎地沙坦抑制LPS 誘導(dǎo)的VSMCs IL-1β和TNF-α分泌中的作用 TLR4 抗體、NADPH氧化酶抑制劑DPI、NF-κB抑制劑PDTC均可以部分抑制LPS（500 ng／m L）誘導(dǎo)的VSMCs IL-1β和TNF-α蛋白表達（P＜0.01），聯(lián)用坎地沙坦（10-5mol／L）可以顯著加強這種抑制作用（P＜0.01），見圖5。結(jié)果提示，坎地沙坦可能通過TLR4／Myd88-iROS-NF-κB信號通路起到對LPS誘導(dǎo)的VSMCs 炎性反應(yīng)的抑制作用。

3 討 論

低度的持續(xù)性炎性反應(yīng)已被證實能夠促進動脈粥樣斑塊發(fā)展和失穩(wěn)［1-2］。TLR4 與LPS 等配體結(jié)合后，通過誘發(fā)相關(guān)炎癥通路激活，上調(diào)多種炎癥因子、趨化因子和黏附分子的表達，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)［8］。此外，TLR4還具有顯著的天然免疫和獲得性免疫調(diào)節(jié)功能［5］。TLR4 能夠通過Myd88 依賴性傳導(dǎo)通路誘發(fā)NF-κB 核轉(zhuǎn)位，增加IL-1β、IL-6 及TNF-α等炎癥因子的分泌；也可通過非Myd88 依賴性傳導(dǎo)通路誘發(fā)干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）核轉(zhuǎn)位，繼而增加干擾素的分泌。以上兩種途徑均能夠顯著促進斑塊的形成和失穩(wěn)［15］。在人類及動物模型的粥樣斑塊內(nèi)，TLR4的表達均有明顯升高［16］。同時給予TLR4 基因敲除和非敲除ApoE-／-小鼠12 周高脂飲食后發(fā)現(xiàn)，TLR4 基因敲除ApoE-／-小鼠動脈粥樣斑塊面積明顯減小，同時穩(wěn)定性增強［15］。據(jù)此可知，TLR4 及其下游通路的激活是動脈粥樣硬化疾病進展的一個重要促進因素。此外，炎性反應(yīng)常伴有iROS 生成增加，iROS 不僅造成細胞亞結(jié)構(gòu)的損傷和信號通路的傳導(dǎo)異常，同時也可以作為第二信使，參與信號傳導(dǎo)。本實驗發(fā)現(xiàn)：給予VSMCs LPS刺激后，TLR4及Myd88 mRNA和蛋白表達均明顯增加；伴隨i ROS合成增加和NF-κB（p65）核轉(zhuǎn)位水平升高，下游IL-1β和TNF-α的分泌亦顯著增加。使用TLR4 特異性抗體、NADPH氧化酶抑制劑DPI 和NF-κB抑制劑PDTC預(yù) 處理VSMCs，能夠顯著抑 制LPS 誘導(dǎo)的VSMCs IL-1β和TNF-α的分泌。上述結(jié)果提示：TLR4／Myd88-iROS-NF-κB 信號通路的激活參與了LPS 誘導(dǎo)的VSMCs 炎癥因子分泌過程。

坎地沙坦是臨床常用的ARB 類降血壓藥物。最近，坎地沙坦已被證實可通過下調(diào)氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮功能等機制，抑制高糖誘導(dǎo)的血管和腎小球細胞炎性反應(yīng)［9，11］。此外，坎地沙坦亦可通過降低TLR4信號通路激活、下調(diào)天然免疫，減輕LPS 引起的小鼠脾臟和腎上腺炎性反應(yīng)［13，17］。臨床研究也表明，輕中度的慢性心功能不全和高血壓患者服用坎地沙坦干預(yù)后，血漿中C反應(yīng)蛋白、IL-6 及MCP-1 等炎癥因子水平明顯下降［18］。在本實驗中，坎地沙坦可以劑量依賴性地降低VSMCs TLR4 m RNA和蛋白表達；抑制iROS 的生成和NFκB 激活；進而減少炎癥因子的釋放，起到有效的抗炎作用。此外，坎地沙坦和TLR4特異性抗體、NAPDH抑制劑DPI 和NF-κB 抑制劑PDTC聯(lián)用，顯示出更顯著的炎癥因子表達抑制作用。據(jù)此可知，坎地沙坦能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs IL-1β和TNF-α 分泌，這可能與坎地沙坦對TLR4／Myd88-iROS-NF-κB 信號通路的抑制作用有關(guān)。上述研究結(jié)果為坎地沙坦應(yīng)用于動脈粥樣硬化的治療提供了一定的實驗依據(jù)。

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