豚鼠乳鼠心房肌細胞體外培養(yǎng)的探討＊

吳 蔚，佡劍非，王曉萍，邵 冰

（1.沈陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院心內科110002；2.中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院神經內科，沈陽110001）

自1960年Harary 等［1］首次對豚鼠乳鼠的心房肌細胞進行培養(yǎng)以來，心房肌細胞培養(yǎng)被廣泛地應用于心血管疾病的研究，其原因在于體外培養(yǎng)的心房肌細胞能夠保持其在體內原有的許多結構和功能，并具有自發(fā)性節(jié)律搏動，且心肌細胞的培養(yǎng)具有簡便、定量、重復性好以及不受神經體液因素的影響等特點［2］，進而在心血管疾病研究領域中起到了不可替代的作用。然而，由于心房肌細胞易受損傷、不易傳代等特點，目前多數學者應用原代培養(yǎng)的心房肌細胞進行實驗。那么，探索出合適的心房肌細胞培養(yǎng)方法，使得心房肌細胞達到理想的數量、存活率、純化率和細胞活力，是體外培養(yǎng)心房肌細胞模型的關鍵。本實驗參照了Simpson 等［3］心房肌細胞的培養(yǎng)方法并加以改進，探討豚鼠乳鼠心房肌細胞培養(yǎng)的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇出生1～2 d 的豚鼠的乳鼠，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。

1.2 儀器與試劑DMEM低糖培養(yǎng)液（美國Hyclone 公司），胎牛血清（美國Hyclone 公司），胰蛋白酶（天津灝洋試劑公司），Ⅱ型膠原酶（美國Gibco 公司），D-Hanks 液（自配），溴脫氧尿核苷（Brdu，美國Sigma 公司），雙抗液（美國Sigma 公司），兔抗大鼠心房肌肌鈣蛋白I（c TnI）抗體（美國Santa Cruz 公司），FITC 標記羊抗兔二抗（北京中杉試劑公司），超凈工作臺（江蘇蘇凈集團儀器設備公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（德國Heraeus 公司），倒置相差光學顯微鏡（日本Ol ympus 公司），離心機（ST-21 Sorvall，美 國），恒 溫 振 蕩 水 浴 箱（Grant OLS200，美國）。

1.3 方法

1.3.1 心房肌細胞的分離及培養(yǎng) 取1～2 d 的豚鼠乳鼠5只，無菌條件下開胸取出心臟，用預冷的D-Hanks 液洗滌1遍，然后用兩把眼科彎鑷子將心房分離下來，再用預冷的DHanks 液洗滌2 遍，剪成約1mm3碎塊，加入4～5 倍體積的0.06%的胰酶并放入37 ℃恒溫振蕩水浴箱中，震蕩（頻率：75 r／min）消化心房肌組織7.5 min，第1 次消化后自然沉淀并棄上清液，并用D-Hanks液洗滌1遍，然后從第2次開始用0.08%Ⅱ型膠原酶消化，前后消化4 次，每次加入后吹打15 次左右，每次消化時間7.5 min，消化后再次吹打20 次左右，自然沉淀后，吸出每次分離的上清液加入等量含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液，前2 次和后2 次各放入1 個15mL離心管中，經200 目濾網過濾，然后4 ℃850r／min 離心8 min，離心后棄掉上清液，各加入1.5 m L培養(yǎng)液，輕輕吹打制成細胞懸液，各吸入6 孔板中，再將其吹勻，各吸出0.5 m L放入另一孔中，然后將6 孔板放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60min 后，采用差速貼壁分離技術，吸出細胞懸液，分別放入另3 個孔中，再放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 min 后，采用同樣的方法再次分別放入另一個6 孔板的3 個孔中，前3d 滴入5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）使其終濃度為0.1 mmol／L，并繼續(xù)培養(yǎng)，24、48 h 都進行換液，以后隔日換液。

1.3.2 心房肌細胞數量及存活率的測定 兩孔中各取40μL細胞懸液，并分別加入160μL 的0.4%臺盼藍液，混勻后再取適量混合液滴于細胞計數板上，隨機取10 個低倍（10 ×）視野計數4 個大格中的細胞總數及未染成藍色的活細胞數，計數10 次，取平均值。細胞存活率＝活細胞數／細胞總數×100%。

1.3.3 心房肌細胞搏動頻率及搏動率的觀察 培養(yǎng)3 d 的心房肌細胞在倒置顯微鏡下先計數聚集成心房肌細胞簇的心房肌細胞的搏動頻率，再隨機在高倍（20 ×）視野中，計數600 個心房肌細胞中搏動心房肌細胞數，得出心房肌細胞搏動率（細胞搏動率＝搏動細胞數／細胞總數×100%），隨機觀察培養(yǎng)4 d的心房肌細胞的形態(tài)變化及生長狀況。

1.3.4 心房肌細胞純度的鑒定 取培養(yǎng)72 h 的心房肌細胞進行純度鑒定，用兔抗大鼠肌鈣蛋白I 抗體作為一抗，山羊抗兔IgG作為二抗熒光蛋白，采用細胞免疫熒光法，用磷酸鹽緩沖液（PBS）作為一抗的陰性對照。隨機取10 個高倍（20 ×）視野計數陽性細胞及細胞總數。陽性細胞率＝陽性細胞數／細胞總數×100%。

2 結 果

2.1 培養(yǎng)心房肌細胞的情況 本實驗采用前2 次、后2 次和前后4 次消化后的細胞分別培養(yǎng)法，觀察3 者對心房肌細胞產量、存活率、純化率和活力的影響，實驗結果顯示采用上述方法中的后2 次消化培養(yǎng)的心房肌細胞總數、存活率和活力更為理想（圖1、圖2）。

2.2 培養(yǎng)心房肌細胞的形態(tài)變化 在兩次差速貼壁后，在倒置顯微鏡下觀察到心房肌細胞形態(tài)，最初為圓形或橢圓形，4 h后，開始有心房肌細胞貼壁生長，此時的形態(tài)為柱狀梭形、長三角形、短三角形；12 h 后，細胞逐漸在瓶壁表面鋪展，此時大多數心房肌細胞已經貼壁生長，此時可見少數單個細胞開始搏動，頻率不一；24 h 后，能貼壁生長的心房肌細胞幾乎都已經貼壁生長，細胞鋪展狀況更加明顯，并伸出偽足，形態(tài)上多數細胞逐漸變成不規(guī)則的星形；1～2 d 后，偽足可相互接觸交織成網，形成細胞單層或細胞簇，呈放射狀排列的同心圓狀，其搏動同步化，形成所謂功能性合體細胞（圖3）；至3 d 時，自發(fā)搏動頻率和波動率都達高峰，計數培養(yǎng)10 次的平均搏動頻率為每分鐘116～119 次，平均搏動率為89%～92%；至5～6d 時搏動頻率及波動率開始減少。

2.3 心房肌細胞純度的鑒定24 孔板爬片培養(yǎng)4 d 的心房肌細胞，以兔抗大鼠肌鈣蛋白I 抗體作為一抗，山羊抗兔IgG作為二抗熒光蛋白，用細胞免疫熒光法，可見細胞質染色呈綠色；細胞核呈藍色，非心房肌細胞只有細胞核呈藍色。結果顯示幾乎所有的細胞呈現陽性，說明此時培養(yǎng)的心房肌細胞較純，見圖1、圖4。

圖1 3組消化后的心房肌細胞存活率及培養(yǎng)4 d的純化率和活力

圖2 3組消化后培養(yǎng)的心房肌細胞密度和總數

圖3 3組消化后培養(yǎng)4d 的心房肌細胞（×200）

圖4 3組消化后培養(yǎng)4d 的心房肌細胞、兔抗大鼠心房肌肌鈣蛋白I、山羊抗兔IgG（×400）

3 討 論

近年來生物起搏器（biological pacemaker）研究已成為緩慢性心律失常治療領域的新熱點，人們對心房肌細胞的研究越來越深入。心房肌細胞原代培養(yǎng)不受神經、體液等因素影響，在實驗研究中具有舉足輕重的作用。然而，由于心房肌細胞有易受損傷、不易傳代等特點，所以如何控制大鼠心房肌細胞體外培養(yǎng)的影響因素，進而得到純化好、存活率和活力高的心房肌細胞，是實驗成功一個關鍵因素。

本實驗利用酶分解法［4］，即0.06%的胰蛋白酶消化1 次，再用0.08%Ⅱ型膠原酶重復消化4 次，并采用差異性貼壁技術及添加Brdu 純化細胞的方法分離豚鼠乳鼠心房肌組織，以獲得高產量、高活力的心房肌細胞。現對豚鼠乳鼠心房肌細胞體外培養(yǎng)的重要影響因素進行總結如下：

3.1 實驗豚鼠的選擇 許多學者研究發(fā)現成年大鼠心肌細胞為終末分化細胞，不具有分裂增殖能力，乳鼠在出生后3 d 內心肌細胞都有增殖能力，但大鼠出生后時間越短，其心肌細胞分離后存活率越高，越容易貼壁生長［5］。而豚鼠在出生后1～3 d 的心房肌細胞都有增殖能力，可用于心房肌細胞培養(yǎng)。有文獻報道，以半日齡為好［6］。作者對出生半日到3 d 的乳鼠進行心房肌細胞培養(yǎng)，發(fā)現胎齡為1～2 d 最好，原因可能是：（1）對于1～3 d 的乳鼠，消化酶對細胞影響較大；（2）對于半日齡的乳鼠，心肌細胞對酶的反復消化耐受差，消化過程不好控制以致細胞的存活率和活力不理想，并且心臟小，細胞數量較少；（3）對于2～3 d 的乳鼠，心房肌細胞增殖和貼壁生長能力較1～2 d 的乳鼠差，消化后細胞的存活率和活力也不理想；（4）對于1～2 d 的乳鼠，消化過程好控制，消化后心房肌細胞數量也較多，且存活率較高，活力較好。

3.2 消化酶種類的選擇 心房肌細胞能否培養(yǎng)成功的關鍵是減輕分離過程對細胞的損傷。有學者認為“單純應用胰蛋白酶消化對細胞的存活率有極大的負面影響”［7］。分離心房肌細胞常用的消化液有胰蛋白酶（一般與依地酸二鈉聯合應用，可降低細胞損害）和膠原酶［8-9］。二者的目的是使組織塊分散為單個細胞，利于細胞貼壁生長。無論是胰蛋白酶還是膠原酶，其濃度較低為好，本實驗選用0.06%的胰蛋白酶（含EDTA）消化1 次，從第2 次開始用0.08%Ⅱ型膠原酶重復消化4 次，就是較好的例子。其原因是0.06%的胰蛋白酶不但對心房肌細胞損害小，而且分解組織間質蛋白的作用較膠原酶強，有利于達到第1 次棄上清液的消化目的，第2 次開始用0.08%Ⅱ型膠原酶，通過消化細胞間膠原蛋白來實現游離心房肌細胞的目的，這與胰蛋白酶消化的機制不同，而且作用溫和，消化的時間長短容易控制，消化次數（與高濃度的消化酶相比，如果消化酶濃度大，需要短時間多次消化）較少。作者嘗試過用0.125%胰酶進行短時間、多次消化，然而消化時間不易控制，效果不理想。總之，選用低濃度的，聯合應用兩種消化酶更適合心房肌細胞培養(yǎng)，這可能是今后心房肌細胞培養(yǎng)的共同趨勢。

3.3 心房肌細胞純化方法的選擇 消化分離后通常存在兩種細胞：心房肌細胞和成纖維細胞。成纖維細胞較心房肌細胞更容易貼壁且具有分裂增殖能力，如果處理不當，很容易成為優(yōu)勢細胞，對實驗結果產生極大的影響。因此，在心房肌細胞培養(yǎng)中應盡可能地去除成纖維細胞，以達到較為純化的心房肌細胞。本實驗根據心肌細胞和成纖維細胞在培養(yǎng)皿表面貼壁生長的速度不同的特點，采用兩次差速貼壁分離法［10-11］（每次60 min）和加入Brdu［3，12］通過競爭取代胸腺嘧啶脫氧核苷，抑制DNA復制，進而抑制混雜于心房肌細胞中的少量成纖維細胞增生，并對心房肌細胞無毒性及抑制作用，可得到純度為95.4%～96.2%的心房肌細胞。

綜上所述，心房肌原代培養(yǎng)在心血管領域中具有重要的作用。那么，如何在心房肌細胞原代培養(yǎng)中獲得達到實驗要求的心房肌細胞數量、存活率、純化率和活力是決定實驗成敗的關鍵。本研究介紹的利用低濃度酶消化原代培養(yǎng)心房肌細胞方法，細胞純化率高、活力高、細胞數量較多、操作簡便、重復性好，且最為值得關注的是實驗操作的可控制性強，是一種較為理想的心房肌細胞原代培養(yǎng)方法，可廣泛地用于建立病理生理模型，研究細胞電生理、蛋白及基因的表達，從而探索以基因治療為基礎的生物起搏器在治療病態(tài)竇房結綜合征中的新途徑。

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