呈味核苷酸含量基體標準物質研究

李 涵， 高運華， 吳 迪， 李倩琪， 楊 屹

（1.北京化工大學，北京 100029；2.中國計量科學研究院，北京 100013）

呈味核苷酸含量基體標準物質研究

李 涵1， 高運華2， 吳 迪1， 李倩琪1， 楊 屹1

（1.北京化工大學，北京 100029；2.中國計量科學研究院，北京 100013）

以市售雞精為基體，研制呈味核苷酸含量基體標準物質。優化雞精中核苷酸提取條件，建立有機溶劑法提取核苷酸的技術手段。以核苷酸國家一級標準物質為標準，采用高效液相色譜外標法、離子色譜外標法兩種技術對雞精基體中呈味核苷酸特性量值進行確定，檢驗標準物質的均勻性和穩定性，結果表明其均勻性良好，且一年內標準物質的特性量值沒有顯著差異。同時建立基于離子色譜和高效液相色譜兩種外標法對標準物質特性量值進行確定的不確定度評定模型，對研制的標準物質進行不確定度評定，為復雜基體中核苷酸含量標準物質的研制提供了借鑒，為呈味核苷酸檢測的相關國家標準制定提供技術參考。

雞精；基體；呈味核苷酸；含量；標準物質；不確定度評定

0 引 言

5′-肌苷酸二鈉（inosine 5′-monophosphate，IMP）和5′-鳥苷酸二鈉（guamosine 5′-monophosphate，GMP）具有呈味性，與谷氨酸鈉具有協同效應，可提高鮮味數十倍，在調味品和食品中應用廣泛[1]。呈味核苷酸和谷氨酸鈉是反映雞精調味料質量的主要指標，SB/T 10371—2003《雞精調味料》規定，雞精調味料中呈味核苷酸二鈉不得低于1.10g/100g，谷氨酸鈉不得低于35.0g/100g。但2008年國家質檢總局調味品抽查結果顯示，個別雞精調味產品中呈味核苷酸二鈉為0.35g/100g，谷氨酸鈉為14.8g/100g，未達到要求。浙江省工商局對流通領域銷售的調味品開展的質量專項檢測也發現，雞精、味精等調味品的關鍵成分谷氨酸鈉、呈味核苷酸明顯不足[2-4]。此外，谷氨酸鈉和呈味核苷酸都屬于雞精最關鍵的質量指標，可部分企業并未將其列入標準項目內。文獻表明，我國現行的核苷酸檢測標準QB/T 2845—2007《食品添加劑呈味核苷酸二鈉》、SB/T 10371—2003《雞精調味料》、SB/T 10415—2007《雞粉調味料》等均為企業標準和行業標準，國家級檢測標準仍為空白，這限制了國家對調味品中呈味核苷酸的技術檢驗[5]。本文以市售雞精為基體，研制呈味核苷酸含量基體標準物質。

1 實驗部分

1.1 儀器設備

高效液相色譜儀：Agilent1200，包括四元低壓梯度輸液泵、二極管陣列檢測器、在線脫氣和柱溫控制系統、自動進樣器、儀器控制和數據處理工作站，（美國Agilent公司）。

離子色譜儀：Dionex ICS-5000，包括梯度混合泵、紫外和電導檢測器、自動進樣器、儀器控制和數據處理工作站，（美國Thermo Scientific公司）。

高速冷凍離心機（Sigma 3K 30，Sigma公司），超純水系統（Millipore QS，Millipore公司），pH計（奧立龍）。

1.2 材料試劑

腺嘌呤核苷一磷酸（AMP）標準物質（GBW09809），胞嘧啶核苷一磷酸（CMP）標準物質（GBW09810），鳥嘌呤核苷一磷酸（GMP）標準物質（GBW09811），尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）標準物質（GBW09812），次黃嘌呤核苷一磷酸（IMP）標準物質（GBW09813）；甲醇（色譜純）、乙酸（優級純）、磷酸二氫鉀（分析純）、磷酸氫二鉀（分析純）、氯仿（色譜純）、雞精（市售）。

1.3 核苷酸提取分離

優化了酸堿沉淀和有機溶劑沉淀兩種方法提取雞精中核苷酸的技術參數，并對兩種提取方法進行了比較，最后確定了氯仿沉淀和高速離心相結合的核苷酸提取方法。具體步驟為：1）用天平精確稱量0.5g雞精樣品（準確至0.000 1g），加入10 g超純水后震蕩混勻1min；2）50～60℃水浴30min，每5min混勻震蕩一次，使雞精中核苷酸充分溶解；3）室溫靜止60min后，加入10mL色譜純的氯仿，震蕩混勻1min；4）20000 r/min離心20 min；5）取上清液過0.22 μm濾膜，4℃貯存待測。

1.4 核苷酸色譜分離分析條件

1.4.1 高效液相色譜條件

色譜柱為Phenomenex，Gemini C18柱，250 mm ×4.6mm（i.d.），粒徑5μm；柱溫25℃；檢測器為DAD檢測器；進樣量10μL；檢測波長：AMP 257nm，CMP 280 nm，GMP.2Na 254 nm，UMP.2Na 262 nm，IMP.2Na 249nm。

流動相由兩部分組成，其中，流動相A為0.1mol/ L磷酸二氫鉀溶液，pH 5.6；流動相B為0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液，pH 5.6，20%（v/v）甲醇。流動相梯度變化見表1。

表1 雞精中核苷酸含量測量色譜梯度洗脫條件

1.4.2 離子色譜分離分析條件

色譜柱：IonPac AGl6保護柱，IonPac ASl6分離柱；柱溫25℃；檢測器UV檢測器；進樣量10μL；檢測波長：AMP 257nm，CMP 280nm，GMP.2Na 254nm，UMP.2Na 262nm，IMP.2Na 249nm。

流動相：KOH溶液。

梯度洗脫程序：0～12min，12mmol/L；12～22min，由12 mmol/L線性增加至55 mmol/L；22～28 min，55 mmol/L；28～28.1 min，由55 mmol/L線性降低至12mmol/L；28.1～33min，12mmol/L，恢復至平衡狀態，流速1.0mL/min。

1.5 標準物質定值及不確定度分析

通過優化流動相、離子強度、pH、有機相含量、分離柱、溫度、電壓等分離分析條件，建立了呈味核苷酸高效液相色譜、離子色譜兩種定量分析方法，以國家一級標準物質為依據，用這兩種方法進行了標準物質特性量值的確定。利用液相色譜方法檢驗了標準物質的均勻性、考察了標準物質的穩定性。基于與國家一級標準物質進行比較，建立了對復雜基體中目標成分含量進行確定的不確定度評定模型，以此評定雞精基體中呈味核苷酸含量標準物質特性量值的不確定度。

2 結果與討論

2.1 核苷酸提取

市售雞精成分復雜，具有相似性質的組份在分析時會相互干擾，因此，核苷酸和干擾成分的有效分離是進行定量分析的基礎。現常用的分離方法有酸堿沉淀法和層析柱法。酸堿沉淀法可有效地將雜質組份與核苷酸分離開來，方法的重復性、準確度均較好，回收率可以達到99%以上；但該方法技術條件要求較高，需要高速離心機、pH計等精密儀器，同時要嚴格控制酸堿等試劑的加入量，對技術人員要求高。層析柱法的優點在于不需要精密儀器，技術要求也不高，普通實驗室和一般技術人員均可操作完成；但其準確度不高，回收率無法保證，限制其廣泛應用。氯仿沉淀和高速離心相結合的核苷酸提取方法可有效地將雞精中對核苷酸定量分析產生干擾的成分分離開來。氯仿和水不互溶，可使蛋白質完全變性沉淀析出，使脂類溶于氯仿中被萃取出來，從而有效去除蛋白質和脂類對核苷酸定量分析的影響；水相中含有鹽、糖、味精、麥芽糊精等水溶性成分，這些成分均沒有紫外吸收，對基于紫外吸收特性檢測的核苷酸定量分析沒有干擾。該方法操作簡便，雖然也需要高速離心機，但是對技術人員的要求不高，普通實驗人員即可完成。且本方法的重復性、準確度均好于酸堿沉淀和柱層析方法。圖1為用氯仿和高速離心方法處理后的核苷酸的高效液相色譜分析圖譜。

圖1 氯仿沉淀處理雞精樣品后HPLC測定圖譜

由圖1可以看出，IMP、GMP和其他干擾成分已經有效分離開，滿足了定量分析的需要。

2.2 核苷酸色譜分離分析條件的優化

2.2.1 核苷酸HPLC色譜分離分析條件

用氯仿和高速離心法處理樣品可將絕大部分干擾成分去除，但是雞精成分較復雜，除了標示的主要成分外，還含有少量可能對核苷酸定量分析產生干擾的成分，從圖1也可以看出，色譜圖中仍有雜質峰。因此，優化色譜分析條件，使核苷酸和其雜質成分有效分開是對其定量的必要條件。分別使用5種核苷酸標準物質及相對應的核苷標準品進行色譜條件建立和驗證，能夠對核苷酸進行準確的定量[6-7]。5種核苷酸標準物質的HPLC測量圖譜見圖2，5種核苷酸標準物質和相對應的核苷標準品的HPLC測量圖譜見圖3。從圖2和圖3可知，5種核苷酸自身與其相對應的核苷都得到有效分離，可以進行定量分析。

圖2 5種核苷酸標準物質的HPLC測量圖

圖3 5種核苷酸標準物質和相對應的核苷標準品的HPLC測量圖譜

2.2.2 核苷酸離子色譜分離分析條件

分別使用5種核苷酸標準物質進行色譜條件建立和驗證，能夠對核苷酸進行準確的定量。5種核苷酸標準物質的IC測量圖譜見圖4，從圖4可知5種核苷酸達到了基線分離，可以進行定量分析。

圖4 5種核苷酸標準物質的IC測量圖譜

2.3 標準物質的均勻性考察

按照國家計量技術規范JJF 1343—2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》中對標準物質均勻性評估的技術要求，從研制的標準物質中隨機抽取15個包裝用高效液相色譜法做均勻性檢驗。采用F檢驗法對均勻性測量數據進行了統計檢驗，檢驗結果見表2。查表得到，F（0.05）=2.31，F＜F（0.05），證明研制的標準物質樣品均勻一致，符合標準物質研制均勻性的要求。

2.4 標準物質的穩定性考察

雞精基體標準物質穩定性檢驗采用高效液相色譜法進行測定。采用國家計量技術規范JJF 1343—2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》推薦的標準物質穩定性評價方法進行了標準物質穩定性檢驗及評價，檢驗結果見圖5。從圖5可知，在12個月時間內標準物質特性量值無顯著性變化，符合標準物質的穩定性要求，檢驗結果為穩定。

表2 雞精標準物質均勻性檢驗結果

圖5 標準物質穩定性監測結果

2.5 標準物質的定值

利用高精密度方法將復雜基體中目標成分含量與已知的標準物質直接比較而確定其特性量值是基體標準物質研制最有效的方法之一。利用本文建立的高效液相色譜和高效離子色譜兩種方法，依據JJF 1343—2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》的要求和ISO導則34的要求，對雞精中每個核苷酸的含量進行精確定量測定，確定了其特性量值，結果見表3。

表3 雞精基體核苷酸標準物質定值結果

2.6 標準物質的定值不確定度分析

本文中標準物質的定值結果不確定度評估主要從核苷酸標準物質、標準物質的配制及系列稀釋、儀器測量、標準物質的不均勻性、標準物質的不穩定性等部分進行了考察。標準物質的不確定度由標準物質證書得到，將其轉換為相對標準不確定度（uC）。標準物質和樣品的配制產生的不確定度（uB）主要包含天平本身的不確定度和標準曲線的線性兩部分。儀器測量不確定度（uM）用多次重復測量的標準偏差表示。色譜不響應成分帶來的不確定度（uS）用水分和無機離子重復測量的標準偏差表示。不均勻性帶來的不確定度（uH）和不穩定性帶來的不確定度（uT）由ISO導則35規定的計算方法進行計算。用如下公式進行合成標準不確定度的計算：

結果為

2.7 定值結果

定值結果表示為標準值±擴展不確定度。取包含因子k=2，則擴展不確定度可以表示為U=k·u。雞精基體（IMP+GMP）核苷酸定值結果為：IMP：（4.08± 0.32）g/100g，（k=2）；GMP：（4.46±0.30）g/100g，（k=2）。

3 結束語

針對國家調味品質量檢驗監督急需的基體標準物質稀缺問題，建立了有機溶劑法提取核苷酸的技術手段。以核苷酸國家一級標準物質為標準，采用高效液相色譜外標法、離子色譜外標法兩種技術對雞精基體中呈味核苷酸特性量值進行了確定，建立了基于離子色譜和高效液相色譜兩種外標法對標準物質特性量值進行確定的不確定度評定模型，評定了定值結果的不確定度，為復雜基體中核苷酸含量標準物質的研制提供了借鑒。為呈味核苷酸檢測的相關國家標準制定提供了技術參考。

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Study on matrix reference material of flavor nucleotides

LI Han1，GAO Yun-hua2，WU Di1，LI Qian-qi1，YANG Yi1
（1.Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China）

The reference material of flavor nucleotides on the chicken essence matrix had been developed.The method was established for extraction the nucleotide with chloroform.The primary reference material for nucleotide had been used as the standard for certifying the value of flavor nucleotides reference materials by the high performance liquid chromatography and ionic chromatography.The homogeneity of reference materials had been tested and the result was good. The stability of reference materials has been monitored and there was no significant difference between the characteristic values within a year.A model was developed to evaluate the uncertainty of reference material of flavor nucleotides on the chicken essence matrix.This paper can be used as the reference for developing the complex matrix nucleotide content reference material and provide the technical information for national standards of nucleotide.

chicken essence；matrix；flavor nucleotides；content；reference material；uncertainty of referenle material

TS264.2+3；O629.74；O657.7+2；Q524

：A

：1674-5124（2014）05-0061-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.05.016

2014-01-19；

：2014-03-23

科技部科技基礎性工作專項（02-08-4GZ）國家質檢總局食品安全監管專項（ASPAQ1201）

李 涵（1987-），女，遼寧本溪市人，碩士研究生，專業方向為分析化學。