雞腹瀉常見病原菌的分離與鑒定

詹先強(qiáng) 俞建萍 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

雞腹瀉常見病原菌的分離與鑒定

詹先強(qiáng) 俞建萍 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

為了深入了解當(dāng)前雞腹瀉常見病原菌的種類及毒力等，本研究通過采集腹瀉患雞的病料，分別用細(xì)菌分離培養(yǎng)法、染色鏡檢法、動(dòng)物試驗(yàn)和血清學(xué)方法進(jìn)行分離與鑒定。試驗(yàn)結(jié)果表明：5株為雞大腸桿菌、3株為肺炎雙球菌、2株為鏈球菌、1株為雞沙門氏菌，其中大腸桿菌、鏈球菌和肺炎雙球菌均可使動(dòng)物發(fā)病率高達(dá)100%。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果提示：50%（4/8）為混合感染，其余為單獨(dú)感染。總之，目前引起雞腹瀉的主要病原菌為大腸桿菌、肺炎雙球菌、鏈球菌、沙門氏菌等。本研究為養(yǎng)禽業(yè)有關(guān)雞腹瀉的正確診斷提供可靠依據(jù)，對(duì)該病的有效防控具有重要的理論指導(dǎo)意義和經(jīng)濟(jì)實(shí)用價(jià)值。

雞腹瀉 病原菌 分離 鑒定

近年來，隨著養(yǎng)禽業(yè)的不斷發(fā)展，雞腹瀉廣泛發(fā)生于全國各地養(yǎng)禽場，并已然成為疾病防治中的一項(xiàng)重點(diǎn)研究對(duì)象。雞腹瀉是由多種病因引起的以排稀糞或水樣糞便為特點(diǎn)的多種疾病的總稱。生產(chǎn)實(shí)踐證明，引起雞腹瀉的病原菌有多種［1-6］：雞白痢沙門氏菌、雞傷寒菌和副傷寒菌、大腸桿菌、鏈球菌、李氏桿菌、耶氏菌等。由于病因復(fù)雜，常給該病的防治帶來許多困難。為更好地了解該病的常見致病菌，為該病的防治提供可靠的條件和依據(jù)，從而指導(dǎo)和運(yùn)用于養(yǎng)雞生產(chǎn)以減少該病帶來的經(jīng)濟(jì)損失，為此，筆者從福建省某發(fā)病雞場隨機(jī)抽檢腹瀉患雞，對(duì)其臨床觀察和剖檢的基礎(chǔ)上，適當(dāng)采集病料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測。

1 材料與方法

1.1 病料來源及有關(guān)情況 從福建省某發(fā)病雞場隨機(jī)抽取485日齡腹瀉烏雞8羽，均按正常標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)管理。患雞消瘦，產(chǎn)蛋率下降，僅為正常的32%。其中有3羽雞排綠色、白綠色或糖稀狀糞便。對(duì)其進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)有2羽雞心臟顏色暗紅，4羽雞肝邊緣出血，2羽雞腎腫大，2羽雞肺壞死。無菌操作采取病料心、肝、脾、肺、腎及小腸、大腸黏膜表面刮取物以備檢驗(yàn)。

1.2 培養(yǎng)基 1%葡萄糖肉湯按常規(guī)方法［7］配制；麥康凱瓊脂、改良馬丁培養(yǎng)基由北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)；營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基由廣東環(huán)凱微生物科技公司生產(chǎn)，以上培養(yǎng)基均按說明書配制使用；綿羊血平板培養(yǎng)基由本公司制備。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

1.3 .1 動(dòng)物來源及飼養(yǎng)管理 ICR小鼠20只，體重18～20 g/只，雌雄各半，購自福州海王福藥制藥有限公司。按正常標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)管理觀察3 d，均正常活潑。

1.3 .2 動(dòng)物分組 將小鼠隨機(jī)分為4個(gè)組，每組5只，其中3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。

1.4 診斷血清及抗原 23種大腸桿菌O因子血清購自中國獸藥監(jiān)察所細(xì)菌室，型號(hào)分別為：O1、O2、O4、O5、O11、O15、O20、O21、O22、O23、O25、O26、O35、O53、O54、O68、O78、O109、O111、O119、O147、O148、O157，均在有效期內(nèi)。雞白痢-雞傷寒多價(jià)平板凝集抗原購自北京中海動(dòng)物保健科技公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)染色鏡檢及純培養(yǎng)

2.1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢 無菌采取病料分別接種于1%葡萄糖肉湯，置37℃培養(yǎng)24 h，然后從中勾菌分別在SS瓊脂、麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板上進(jìn)行劃線分離，置37℃培養(yǎng)24 h，觀察分離菌菌落生長性狀。選定可疑菌落分別劃線于綿羊血平板上，置37℃培養(yǎng)48 h，分別觀察細(xì)菌溶血現(xiàn)象。用分離到的可疑典型菌落分別抹片，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。分離菌株編號(hào)與病料編號(hào)一致。

2.1 .2 增菌純培養(yǎng) 選定單個(gè)可疑典型菌落，無菌操作分別接種于1%葡萄糖肉湯或改良馬丁培養(yǎng)基，置37℃、24 h進(jìn)行純培養(yǎng)。

2.2 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 將已選定的可疑分離菌株肉湯純培養(yǎng)物分別接種試驗(yàn)組小白鼠，每組（5只）接種1種分離菌，每只腹腔注射0.2 mL，對(duì)照組接種等量的肉湯培養(yǎng)基。注射后連同對(duì)照組連續(xù)觀察7 d，記錄發(fā)病情況。第7 d對(duì)所有的小白鼠進(jìn)行剖解，觀察病變，取其病料，抹片染色鏡檢，并分離培養(yǎng)，回收接種菌。

2.3 細(xì)菌血清學(xué)鑒定

2.3 .1 菌體O抗原的制備 分別將可疑分離菌株在普通瓊脂平板上37℃、24 h進(jìn)行培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)物用少量0.5%石炭酸生理鹽水沖洗，并分別收集于青霉素瓶中，包裝后置121℃加熱處理100 min。

2.3 .2 O因子血清平板凝集試驗(yàn) 用微量加樣器分別吸取各種O因子血清50 uL置于潔凈微量反應(yīng)板上，然后再吸取已制備的菌體抗原進(jìn)行混勻。若細(xì)菌抗原與相應(yīng)血清作用，則3 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)，同時(shí)分離菌抗原需作抗原對(duì)照，應(yīng)均無自凝現(xiàn)象。

3 結(jié)果

3.1 分離培養(yǎng)及染色鏡檢結(jié)果見表1。

表1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢

3.2 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 接種后2 h，15只小白鼠全部發(fā)病，扎堆、炸毛、精神沉郁、呼吸急促。連續(xù)觀察7 d，所有試驗(yàn)組菌株均未使小白鼠死亡，對(duì)照組均正常。但攻毒前后對(duì)照組體重增幅明顯高于試驗(yàn)組。對(duì)試驗(yàn)組所有小白鼠進(jìn)行解剖觀察，雞大腸桿菌組有3只鼠腸道有大量氣泡、黃色內(nèi)容物，1只鼠肝表面有較多出血點(diǎn)、質(zhì)地較脆，1只鼠脾臟色澤較淺；攻雞鏈球菌組有3只鼠肝邊緣稍發(fā)白，2只鼠肝表面有少量出血；攻雞肺炎雙球菌組有2只鼠肺發(fā)白，并且其中1只肺壞死，另有1只心腫大，1只有心包炎。對(duì)照組小白鼠經(jīng)剖檢無病變出現(xiàn)。剖檢鏡檢觀察從其肝臟中分別分離出的菌株形態(tài)與攻毒菌一致。發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

3.3 血清學(xué)鑒定結(jié)果 結(jié)果見表3。

大腸桿菌O因子血清凝集試驗(yàn)分離的5株雞大腸桿菌均與雞大腸桿菌O119因子血清發(fā)生快速凝集，強(qiáng)陽性，因此，可確定5個(gè)菌株血清型均為O119。

表2 分離菌動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

表3 分離菌血清學(xué)鑒定結(jié)果

4 小結(jié)與討論

4.1 小結(jié) 雞腹瀉主要病原性細(xì)菌為O119雞大腸桿菌，其次為肺炎雙球菌、雞鏈球菌、雞沙門氏菌等。

4.2 討論

1）對(duì)細(xì)菌進(jìn)行抹片染色、鏡檢、分離培養(yǎng)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)、O因子血清凝集試驗(yàn)鑒定，結(jié)果證實(shí)雞腹瀉主要由病原性細(xì)菌引起，其中5株O119型雞大腸桿菌、3株肺炎雙球菌、2株鏈球菌、1株雞沙門氏菌。對(duì)于導(dǎo)致雞腹瀉的研究國內(nèi)外已有許多報(bào)道，但對(duì)于烏雞腹瀉病原菌的混合感染研究報(bào)道極少，故本研究可為烏雞腹瀉的正確診斷提供重要依據(jù)。

2）動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果表明：雞大腸桿菌、肺炎雙球菌和鏈球菌接種試驗(yàn)動(dòng)物均可導(dǎo)致發(fā)病。腸致死性大腸桿菌在十二指腸、空腸和回腸黏膜表面大量繁殖，黏附于微絨毛，導(dǎo)致刷狀緣被破壞，微絨毛斷裂，上皮細(xì)胞排列紊亂和功能受損，造成嚴(yán)重腹瀉［7-8］。禽鏈球菌病又稱鏈球菌性敗血癥，是禽類的一種急性、敗血性傳染病，該病菌自1979年起有雛雞鏈球菌病的報(bào)道［9］，該病在世界許多國家都有發(fā)生，多呈地方性流行，也常呈散發(fā)，嚴(yán)重時(shí)呈毀滅性流行。而肺炎雙球菌會(huì)引起肺腫大、呼吸急促。多種病菌引起的雞腹瀉使養(yǎng)殖戶受到經(jīng)濟(jì)損失。目前從臨床發(fā)病的烏雞來看，致病力相對(duì)較弱，主要表現(xiàn)為排稀便、精神不振、食欲下降，但菌株毒力不是很強(qiáng)，無死亡發(fā)生。但由于患雞長期發(fā)生腹瀉，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，因此，應(yīng)引起高度重視。

3）O因子血清鑒定結(jié)果表明，發(fā)病雞場大腸桿菌的主要血清型為O119型，與參考文獻(xiàn)報(bào)道基本吻合［10］。故建議各地在進(jìn)行雞大腸桿菌病的免疫預(yù)防時(shí)，所選疫苗的血清型一定要與當(dāng)?shù)亓餍芯晗辔呛希詈眠x用當(dāng)?shù)胤蛛x株的自家菌苗，這樣才能有效預(yù)防該病，否則會(huì)導(dǎo)致免疫效果不良或失敗，給養(yǎng)雞生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

4）本試驗(yàn)從病料中分離出了1株沙門氏菌，由于時(shí)間和條件所限，目前未能確定其血清型。有關(guān)其血清型和更多的生化試驗(yàn)內(nèi)容均有待進(jìn)一步深入研究。

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1003-4331（2014）01-0007-03