作物遺傳育種研究進展Ⅲ.作物基因工程與基因組編輯

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙410128）

作物遺傳育種研究進展Ⅲ.作物基因工程與基因組編輯

劉忠松

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙410128）

從育種應(yīng)用角度對利用基因工程和基因組編輯技術(shù)拓寬作物遺傳變異的意義、特點、原理和基本方法進行了評述，著重介紹了近10年來內(nèi)源轉(zhuǎn)基因和同源轉(zhuǎn)基因、新靶標基因、多基因工程、葉綠體基因工程和基因組編輯技術(shù)的研究新進展，同時比較了它們的優(yōu)缺點，以期為合理選擇利用這些新技術(shù)創(chuàng)制新種質(zhì)提供基礎(chǔ)。

作物；遺傳育種；基因工程；基因組編輯

遺傳變異是育種選擇的基礎(chǔ)。遺傳變異的主要來源一是基因突變，二是基因重組，三是基因轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)的基因工程使基因在不同物種間實現(xiàn)轉(zhuǎn)移，是利用基因轉(zhuǎn)移擴大作物遺傳變異的重要途徑，在作物育種上已經(jīng)廣泛利用，已培育出第一代、第二代轉(zhuǎn)基因作物［1，2］。近年來開發(fā)的基因組編輯技術(shù)可使作物基因組進行定點改造，通過斷裂的雙鏈DNA非同源末端結(jié)合或同源重組，導(dǎo)致基因突變、基因重組和基因轉(zhuǎn)移，將在定向改變作物的遺傳、拓寬作物遺傳變異來源中發(fā)揮重要作用。此外，轉(zhuǎn)基因和基因組編輯也是研究基因功能的重要方法。

1 作物基因工程

基因工程是指將不同DNA（或基因）在體外進行酶切和連接，構(gòu)成重組DNA分子，然后借助生物方法或理化方法將外源基因?qū)氲街参锛毎瑢?dǎo)入的目的基因整合到植物基因組進行穩(wěn)定的表達而實現(xiàn)改變植物特定性狀的目的。

1.1 內(nèi)源轉(zhuǎn)基因和同源轉(zhuǎn)基因

由于遺傳密碼具有通用性，基因可在不同的生物之間進行交流或轉(zhuǎn)譯，因而轉(zhuǎn)基因的目的基因可來源于植物、動物和微生物甚或人工合成。第一代轉(zhuǎn)基因作物的目的基因抗除草劑、抗蟲基因主要來自于細菌，這引發(fā)人們對轉(zhuǎn)基因安全性的擔憂。為了解決轉(zhuǎn)基因安全性問題，Rommens［3］和Schouten等［4］提出了intragenesis（內(nèi)源轉(zhuǎn)基因）和cisgenesis（同源轉(zhuǎn)基因），即利用雜交親和的植物來源的基因作為轉(zhuǎn)基因的目的基因。在同源轉(zhuǎn)基因中包括啟動子、終止子在內(nèi)的目的基因來自于同種作物或雜交親和植物，完整轉(zhuǎn)移，不對基因進行改造操作，而在內(nèi)源轉(zhuǎn)基因中目的基因的各個部分可能來自于同種作物或雜交親和植物的不同基因，需將不同基因的各功能成分（編碼區(qū)、啟動子、終止子）進行重組（圖1）［5］。

圖1 同源轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源轉(zhuǎn)基因的比較

1.2 基因工程的新靶標

基因多數(shù)編碼蛋白質(zhì)，如編碼酶的基因、編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，但也有不編碼蛋白質(zhì)、而編碼RNA的基因，如microRNA基因。第一代甚至第二代轉(zhuǎn)基因主要集中在編碼酶的基因，以期改善作物的投入性狀（如抗除草劑、抗蟲）和產(chǎn)出性狀（如富營養(yǎng)化等品質(zhì)性狀）。轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控遺傳網(wǎng)絡(luò)中多個基因的表達，利用轉(zhuǎn)錄因子基因進行轉(zhuǎn)基因?qū)⒏淖円粭l路徑上全部或多個基因的表達，因此可用于復(fù)雜性狀（如抗旱性）的改良。但利用轉(zhuǎn)錄因子基因進行轉(zhuǎn)基因時，應(yīng)注意轉(zhuǎn)錄因子基因的表達具有時空特征，需要利用組織專一性或誘導(dǎo)性表達啟動子［6］。小RNA是指長度短于200個堿基的RNA，包括microRNA、小干擾RNA（siRNA）等，它們通過剪切基因轉(zhuǎn)錄本或抑制轉(zhuǎn)錄本翻譯而使基因沉默，從而調(diào)控基因的表達。通過增強或干擾小RNA基因的表達可以改變小RNA基因調(diào)控的靶標基因控制的性狀的表達（圖2）［7～10］。

圖2 基于小RNA基因的轉(zhuǎn)基因策略

1.3 多基因基因工程和基因聚合

作物的許多性狀都是復(fù)雜的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制的，導(dǎo)致單個基因?qū)π誀畹母牧纪荒軠愋В枰瑫r導(dǎo)入多個有利基因才能達到目的。多基因基因工程有多條途徑（圖3）［11］。一是基因聚合（圖3A），攜帶不同轉(zhuǎn)基因的植株通過傳統(tǒng)育種方法雜交、回交，將轉(zhuǎn)基因聚合到優(yōu)良品種中，這種轉(zhuǎn)基因聚合方法也叫做育種聚合（breeding stack）。育種聚合花費時間長，能聚合的基因數(shù)目有限（4個以內(nèi)），而且在后代中會發(fā)生遺傳分離，難以保持。二是重復(fù)轉(zhuǎn)化（圖3B），轉(zhuǎn)基因植株作為受體材料用另一基因的表達載體再轉(zhuǎn)化。這種途徑需要多輪轉(zhuǎn)化，在每次轉(zhuǎn)化時需要用不同的選擇標記基因或?qū)擞浕蚯谐蚍謩e整合和表達，在后代中分離，需要回交而且難以獲得所有轉(zhuǎn)基因的純合系。三是非連鎖基因共轉(zhuǎn)化（圖3C），將多個目的基因分別構(gòu)建載體，然后同時通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍方法對受體進行轉(zhuǎn)化，多個基因往往能隨機串聯(lián)整合到受體的同一位點，但對多個基因（3個基因）不適用。四是連鎖基因轉(zhuǎn)化（圖3D），有時也叫分子聚合（molecular stack），是將多個目的基因轉(zhuǎn)化到同一表達載體，用一個載體進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因整合到基因組的一個位點。由于轉(zhuǎn)基因緊密連鎖，后代轉(zhuǎn)基因基本不會發(fā)生分離。這種途徑存在的問題是多個基因（如8～10個基因）在進行克隆、組裝時可能需要用不同的啟動子［13］，需要有合適的限制酶切位點和載體構(gòu)建平臺［14］。由于合成生物學(xué)的興起，合成DNA或基因方便而高效，這一問題已迎刃而解。另一問題是需要用高容量轉(zhuǎn)化載體如BIBAC、TAC等，即使這樣，轉(zhuǎn)化上限也在200 kb以下（一般80～150 kb），而且載體不穩(wěn)定，容易片段化，位于載體3′端的基因往往表達低。為了克服這一問題，并將更多基因同時進行轉(zhuǎn)化，正在致力于人工染色體或合成染色體研究。人工染色體長達幾個Mb，能攜帶數(shù)十甚至數(shù)百個基因，且目標基因的導(dǎo)入不會破壞內(nèi)源基因的表達，因此是多基因轉(zhuǎn)移有希望的載體［15］。

圖3 多基因基因工程途徑

1.4 葉綠體基因工程

植物細胞除了有細胞核基因組外，細胞質(zhì)的葉綠體和線粒體也有自己的基因組。盡管線粒體基因工程停滯不前，但葉綠體基因工程已取得突破，近20種雙子葉植物都能通過基因槍轉(zhuǎn)化獲得質(zhì)體轉(zhuǎn)基因植株［16］。

與細胞核轉(zhuǎn)基因相比，質(zhì)體轉(zhuǎn)基因具有4大優(yōu)勢：（1）大多數(shù)植物的質(zhì)體為細胞質(zhì)遺傳，轉(zhuǎn)基因不會通過花粉擴散；（2）一個細胞中有上百個質(zhì)體，每個質(zhì)體中有上百個基因組，同質(zhì)的轉(zhuǎn)基因質(zhì)體的拷貝數(shù)多，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因高水平表達；（3）質(zhì)體基因不會發(fā)生基因沉默，轉(zhuǎn)基因表達穩(wěn)定；（4）質(zhì)體基因組為原核基因組，基因以操縱子形式排列，適宜多基因轉(zhuǎn)化。

與核轉(zhuǎn)基因的隨機整合不同，葉綠體轉(zhuǎn)基因通過同源重組定點整合到葉綠體基因組（圖4B），因此利用葉綠體基因序列作為同源重組序列（圖4A）來構(gòu)建表達框。葉綠體基因組具有原核生物的特點，基因以多順反子進行表達，且采用基因槍進行葉綠體基因轉(zhuǎn)化，能導(dǎo)入50 kb大小DNA到葉綠體，因此適合多基因的轉(zhuǎn)化（圖3E），在光合作用、品質(zhì)代謝、抗性改良和重組蛋白生產(chǎn)均有重要作用。葉綠體轉(zhuǎn)基因雖然不能通過花粉有性轉(zhuǎn)移，但可以通過無性嫁接實現(xiàn)在細胞間轉(zhuǎn)移［17］，利用嫁接融合體細胞再生將葉綠體轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到其他植物。

葉綠體轉(zhuǎn)基因目前在單子葉植物上尚未取得成功，需要利用綠色葉片進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過程繁瑣，組織培養(yǎng)必不可少，轉(zhuǎn)基因只在綠色組織高表達，而在非綠色組織是低表達，因此需要研究如何提高非綠色組織葉綠體轉(zhuǎn)基因的表達，利用非綠色組織高表達基因（如accD基因）的啟動子和5′端調(diào)控元件可能是途徑之一。

2 作物基因組編輯

基因工程是將單個或少數(shù)幾個結(jié)構(gòu)和功能已知的目的基因插入到作物的基因組，而基因組編輯是將DNA雙鏈定點切開，使雙鏈斷裂，DNA雙鏈斷裂后，能夠激活細胞內(nèi)固有的非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）機制，將斷裂的DNA修復(fù)，DNA修復(fù)過程可導(dǎo)致基因插入、基因點突變、染色體結(jié)構(gòu)變異（圖5）［18］。

2.1 基因組編輯的主要特點

基因組編輯是利用蛋白或RNA對基因組的特定序列具有專一識別的特性設(shè)計、構(gòu)建人工內(nèi)切核酸酶，從而使DNA雙鏈在特定位置斷裂，因此這種斷裂是位點特異的，可以對基因進行定向突變。

決定基因組編輯的靶標位點短（表1），只要有作物的基因組序列或基因序列，就可以利用計算機進行靶標位點預(yù)測，基因組中任意符合條件的位點均可進行編輯，基因組編輯頻率高。

基因組編輯既可以通過病毒載體進行瞬時轉(zhuǎn)化，又可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化進行。由于基因組編輯是使靶標基因突變，而核酸酶轉(zhuǎn)基因可以通過雜交分離去除，基因組編輯的結(jié)果是非轉(zhuǎn)基因植株（圖6）［19］。

2.2 基因組編輯技術(shù)

從2005年基因組編輯技術(shù)出現(xiàn)以來，已開發(fā)的基因組編輯技術(shù)有鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)／Cas9蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR／Cas9）三種技術(shù)（圖7）［18，20，21］。

ZFN是人工將具有獨特的DNA序列識別的鋅指蛋白（zinc finger，ZF）與非特異性核酸內(nèi)切酶（nuclease）FokⅠ連接合成的酶，其中鋅指蛋白負責(zé)DNA特異序列的識別，每個鋅指蛋白都能夠識別一個特定的三聯(lián)體堿基，在鋅指蛋白的指導(dǎo)下FokⅠ二聚體在特定的位置將DNA雙鏈切開。

TALEN是用類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)物（TALE）代替了鋅指蛋白作為DNA結(jié)合域與FokⅠ切割結(jié)構(gòu)連接形成的核酸酶。通過TALE（由33～35個氨基酸的重復(fù)序列構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)因子蛋白）第12位和第13位氨基酸（這兩個氨基酸被稱為RVDs）識別特異的DNA序列，F(xiàn)okⅠ酶二聚化產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性，從而在特定位點將DNA序列精確切開。目前已發(fā)現(xiàn)了5種RVDs，分別與特異的堿基對應(yīng)：組氨酸-天冬氨酸（HD）特異識別堿基C、天冬酰胺-異亮氨酸（NI）識別堿基A、天冬酰胺-天冬酰胺（NN）識別堿基G或A、天冬酰胺-甘氨酸（NG）識別堿基T、天冬酰胺-絲氨酸（NK）可以識別A、T、C、G中的任一種。由于TALEN的RVD對于核苷酸的識別是一一對應(yīng)的，為識別某一特定氨基酸序列，只需要設(shè)計相應(yīng)TALE單元串聯(lián)克隆即可，所以TALEN的設(shè)計、構(gòu)建和篩選比ZFN簡單得多，具備比ZFN更廣闊的應(yīng)用潛力。

CRISPR／Cas9基因組編輯技術(shù)不同于ZFN和TALEN基因組編輯技術(shù)，它不是以蛋白質(zhì)識別DNA序列，而是以一條短的向?qū)NA識別特異結(jié)合的DNA序列，通過CRISPR位點附近的雙鏈DNA核酸內(nèi)切酶Cas9在向?qū)NA引導(dǎo)下對靶標位點進行切割。Cas9與FokⅠ酶的功能類似，但是它并不需要形成二聚體就能發(fā)揮作用。CRISPR／Cas9基因組編輯技術(shù)只需要設(shè)計短的向?qū)NA序列，設(shè)計、組裝都很方便，因此快速得到了應(yīng)用，在基因組編輯技術(shù)中似有后來居上之勢［22，23］。

上述3種基因組編輯技術(shù)在原理、修飾效率、構(gòu)建方法、操作難度以及應(yīng)用成本等方面具有較大差異（表1）。

表1 基因組編輯技術(shù)比較［18，20，21］

2.3 基因組編輯技術(shù)改良植物基因組的步驟

（1）分析和確定待改良性狀及其目標基因；（2）針對目標基因DNA序列構(gòu)建1對（或多對）內(nèi)切核酸酶表達基因盒，并將其裝載入合適的植物表達載體；（3）利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等遺傳轉(zhuǎn)化途徑，將工程核酸酶基因表達盒導(dǎo)入目標植物細胞；（4）分化獲得轉(zhuǎn)工程核酸酶基因植株；（5）對轉(zhuǎn)基因植株進行剪切位點的DNA序列分析及目標基因的表達分析；（6）對轉(zhuǎn)基因植株進行表型檢測，包括目標基因性狀和其它主要農(nóng)藝性狀；（7）轉(zhuǎn)基因植株通過自交或與其它材料雜交，篩選剔除轉(zhuǎn)入的外源DNA片段、同時目標基因又得到了修飾的轉(zhuǎn)基因植株；（8）與常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合，培育剔除不利性狀基因或激活目標基因的植物新品種。在這些環(huán)節(jié)中，也可以在分化獲得轉(zhuǎn)基因植株前，在細胞水平檢測不同工程核酸酶的定點剪切效果，并確定是否對工程核酸酶基因表達盒進行優(yōu)化。

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S330

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2014 04 21

劉忠松（1963-），男，湖南常寧人，博士，教授，從事作物遺傳育種研究與教學(xué)。