主要釀造因子對野生酵母β-葡萄糖苷酶產量的影響

王玉霞，張　超（．宜賓學院生命科學與食品工程學院，發酵資源與利用四川省高校重點實驗室，生物工程研究所，四川宜賓644000；2．宜賓學院生命科學與食品工程學院，發酵資源與利用四川省高校重點實驗室，食品科學與工程研究所，四川宜賓644000）

主要釀造因子對野生酵母β-葡萄糖苷酶產量的影響

王玉霞1，張超2，*
（1．宜賓學院生命科學與食品工程學院，發酵資源與利用四川省高校重點實驗室，生物工程研究所，四川宜賓644000；2．宜賓學院生命科學與食品工程學院，發酵資源與利用四川省高校重點實驗室，食品科學與工程研究所，四川宜賓644000）

實驗考察了典型葡萄酒釀造因子糖、酸、醇對野生酵母β-葡萄糖苷酶產量的影響，以評價菌株在葡萄酒釀造條件下的應用性能。結果表明，各菌株β-葡萄糖苷酶主要定位在胞內，總酶活力以H.uvarum菌株的0.51U/mL為最高，P.fermentans菌株最小。各釀造因子對菌株產β-葡萄糖苷酶產量的影響差異較大。較高初始糖含量和低pH條件對各菌株產酶都有顯著地抑制作用，其中P.fermentans菌株受抑制作用最大，在pH3.0條件下受抑制程度達到了63.50%～84.32%，Saccharomyces和Hanseniaspora兩屬酵母受影響較小，且H.uvarum在酸性條件下的產酶量最高。較低濃度的乙醇（5%）對菌株產酶有一定的促進作用，隨著乙醇含量的增加，各菌株產酶量都受到了顯著抑制，P.fermentans菌株甚至沒有酶的產生。綜合各因子對各菌株產酶量的影響情況，H.uvarum菌株以較優表現展示出其較好的應用前景。

野生酵母，β-葡糖苷酶，釀造因子

來自水果等原料的香氣物質，以游離態和結合態兩種方式存在。游離態香氣物質直接呈現出能被感知的氣味，而含量較多的無色、無味、不具揮發性結合態的香氣多數為糖苷類物質，必須經過水解才能使香氣表現出來[1-3]。糖苷類風味物質的水解分為酸水解和酶水解兩類。其中作用溫和、反應迅速、高效率的酶水解，在生產中倍受青睞[4]。β-D-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）是一類能水解糖鏈非還原末端糖苷鍵的一類水解酶。因廣泛用于果汁、果酒等結合態風味物質的水解，釋放香氣成分而被稱為風味酶。糖苷類風味物質的水解涉及多種酶的參與，β-葡萄糖苷酶是其中的關鍵酶[5-6]。

β-葡萄糖苷酶在自然界的分布非常廣泛，包括植物、動物、昆蟲、絲狀真菌、酵母菌、細菌等[1，7]。與植物、動物、昆蟲以及細菌相比，酵母細胞所具有的培養、生長特性，使從酵母菌中篩選比活高、特性優良的β-葡萄糖苷酶成為優勢。尤其是從釀造環境中篩選能體現區域酒種風格的優良酵母，這個優勢就更為明顯了[8-9]。

實驗通過考察典型葡萄酒釀造因子糖、酸、醇對酵母β-葡萄糖苷酶產量的影響，評價酵母菌株在葡萄酒釀造中的應用潛能，為產β-葡萄糖苷酶酵母菌的生產應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

所用菌株分離自果園土壤，鑒定為Hanseniaspora uvarum、Saccharomyces cerevisiae和Pichia fermentans菌株；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉 英國oxoid公司，分析純；葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸、無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鈉、咪唑、GSH、曲通、甲苯、乙醇中國醫藥集團上海化學試劑公司，分析純；pNPG（p-nitrophenyl-β-D-glycoside）Sigma-Aldrich，分析純；其余所有試劑均為分析純。

HX-9080B-2型生化恒溫培養箱上海福碼實驗設備有限公司；PB2002-N型稱量天平、AB204-E型分析天平、320-S型精密pH計Delta瑞士Mettler Toledo公司；SS325型高壓蒸汽全自動滅菌鍋日本Tomy公司；無菌超凈工作臺蘇州凈化設備廠；酶標儀美國Thermo公司；3K型冷凍高速離心機德國Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1β-葡萄糖苷酶活力測定pH5.0 P-C緩沖溶液：稱取Na2HPO43.689g、C6H8O71.01g溶于100mL蒸餾水中，調pH至5.0并定容。底物（pNPG）工作液：準確稱取150.65mg pNPG，完全溶解于100mL pH5.0的P-C緩沖中備用。

酶活測定：將菌株28℃靜置培養3d的發酵液4℃，8000×g離心5min，取5μL上清液與100μL底物pNPG溶液（5mmol/L）混勻，50℃保溫30min，加入200μL 1mol/L Na2CO3中止反應并顯色，將反應液在400nm下用酶標儀測定吸光值[10]。

酶活力單位定義：在標準檢測條件下，每分鐘水解產生1μmol的pNP所用的酶量為一個酶活單位[10]。

1.2.2培養基液體YPD（w/v）：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。依據葡萄醪平均pH（3.5～4.0）、葡萄醪平均糖含量（20%）、普通葡萄酒酒度（12%），分別對選擇的代表菌株進行不同逆境條件下產酶情況的考察。產酶條件分別選培養初始條件為葡萄糖含量20%（200g/L），pH3.0、4.0、5.0以及5%、10%、15%的乙醇濃度。以5%接種量分別接種各類培養基，28℃，200r/min搖瓶培養，三次重復。每天測定酶產量，連續9d，以考察產酶量的最大時間及各菌株產酶差異情況。對照為2%葡萄糖的普通YPD培養基，pH自然，不加乙醇。在考察20%葡萄糖初始含糖量對菌株產酶情況影響實驗中，實驗測定酶產量的同時，監控測定培養基pH變化情況。

1.2.3酶在細胞的定位YPD培養基50mL/250mL三角瓶，5%接種量，30℃，200r/min，培養48h。

取1mL細胞培養液8，000×g、4℃條件下離心15min，取上清液并測定酶活（胞外）；收集細胞用無菌水清洗兩次、8，000×g、4℃條件下離心10min后，棄去上清液，向沉淀中加入0.2mL P-C緩沖溶液（pH5.0），漩渦振蕩均勻，按常規方法測定酶活（細胞膜）。

另取5mL細胞培養液8，000×g、4℃條件下離心15min，收集細胞用無菌水清洗兩次、8，000×g、4℃條件下離心10min后，向細胞沉淀中加入1mL咪唑、50μL GSH、10μL曲通、50μL甲苯∶乙醇（1∶4，v/v），漩渦振蕩5min，8，000×g、4℃條件下離心5min后收集沉淀，加入5mL無菌冰水搖勻后，取1mL冰水溶液離心并用冰水洗滌數次，收集沉淀，加入0.2mL P-C緩沖溶液（pH5.0），溶液按常規方法測定酶活（細胞內）[11]。所有測定均重復三次。

1.3數據統計

實驗數據應用SPSS19.0進行處理分析。

2　結果與分析

2.1酶在細胞的定位

在對各野生菌株產酶情況考察之前，首先分析了不同產酶菌株β-葡萄糖苷酶在細胞中的定位情況。從圖1中數據分析在胞內、細胞膜和細胞外β-葡萄糖苷酶活力分布情況，可以得出，所有參試種屬菌株的酶都主要定位在細胞內，約占了全部酶活的39.30%～47.35%，其中胞內酶活比例占的最大的是P.fermentans酵母，最低的是S.cerevisiae酵母。S.cerevisiae和H.uvarum酵母胞外酶活比例較大，最小的是P.fermentans酵母，只有21.25%的β-葡萄糖苷酶活在細胞培養上清液中存在。三個菌株定位在細胞膜的β-葡萄糖苷酶差異不是很大，集中在28.45～32.80%這個小范圍內。

圖1　菌株β-葡萄糖苷酶定位情況Fig.1　Enzyme location of different yeast strains

然而從各菌株總酶活情況可以得出（圖2），三個菌株的總酶活H.uvarum最大，達到0.51U/mL，其次是S.cerevisiae菌株（0.43U/mL），最低的是P.fermentans 0.22U/mL，只有最高總酶活力H.uvarum菌株的42.55%。

圖2　菌株β-葡萄糖苷酶總酶活Fig.2　Total enzymatic activities from different yeast strains

2.2釀造因子對酶產量的影響

2.2.1200g/L葡萄糖對各菌株產酶的影響從表1數據可以看出，與對照培養基相比，菌株在高糖培養條件下，生長過程中pH都比較低。這是由于高碳氮比培養條件下，微生物代謝過程菌體產酸能力提高，以及菌體在高糖環境下，自身對這種脅迫效應的一種保護機制。

表1　高糖條件下各菌株發酵過程中pH變化情況Table 1　pH change of different strains with high glucose fermentation

表2　高糖條件下各菌株產酶情況比較Table 2　Comparison the enzyme production of different strains under high glucose concentration

表2數據展示了各菌株在高糖和對照培養基中產酶變化情況。三個菌株在高糖條件下的產酶量分別為P.fermentans菌株0.045～0.140U/mL，H.uvarum菌株0.206～1.750U/mL，S.cerevisiae菌株0.100～1.110U/mL，而對照培養基中的產酶量分別為P.fermentans菌株0.137～0.741U/mL，H.uvarum菌株0.415～2.520U/mL，S.cerevisiae菌株0.346～2.443U/mL。與對照相比，高濃度葡萄糖含量對各菌株產β-葡萄糖苷酶能力都表示出了顯著的抑制作用。其中受高葡萄糖影響最強的是P.fermentans菌株，與對照培養基相比，高糖條件下產酶量減少了67.15%～81.54%，其次是S.cerevisiae菌株的48.28%～71.10%。H.uvarum在三個菌株中表現最優，在對照和高糖條件下產酶量都顯著高于其他菌株，在兩種培養條件下的最大產酶量分別為1.75U/mL和2.52U/mL。在測試期間內，高糖初始條件對H.uvarum菌株產酶的抑制作用，除第1d外（50.36%），基本在50%范圍以下，遠低于P.fermentans和S.cerevisiae菌株。由此可見，在相同培養條件下，H.uvarum菌株顯著高于其他菌株，表現出了較強于其他菌株的應用性能。

2.2.2低pH對各菌株產酶的影響由表3可知，分屬于三個種的參試菌株的產酶情況，都顯著受到低pH的強烈抑制，其中pH3.0對各菌株的產酶量影響最大。與對照相比，在pH3.0條件下，P.fermentans受到的抑制作用達到了63.50%～84.32%，其次是S.cerevisiae菌株的59.76%～82.08%。受抑制程度最小的是H.uvarum菌株，產酶量達到了0.078～0.871U/mL（pH3.0條件下），0.320～1.613U/mL（pH4.0條件下），0.331～1.964U/mL（pH5.0條件下）。隨著pH升高，各菌株產酶量顯著增加。在相同pH條件下，三個菌株的產酶量差異較大，其中H.uvarum菌株比P.fermentans和S.cerevisiae菌株的產酶量要高，且達到了顯著差異水平，三個菌株產酶量從高到低的順序是H.uvarum菌株、S.cerevisiae菌株、P.fermentans菌株。與其他菌株相比，H.uvarum菌株在低pH條件下較好地產酶特性，顯示出此菌較好地在低pH條件下的應用潛能。

表3　不同初始pH條件下各菌株產酶情況Table 3　Production of enzyme with different start pH values

2.2.3乙醇對各菌株產酶的影響從不同濃度乙醇實驗結果（見表4）可以得出，低濃度乙醇對各菌株的產酶都有一定程度的促進作用。含有初始濃度5%乙醇的培養條件下，三個菌株的產酶量，在前期基本都有顯著地增加，其中P.fermentans菌株在第5d的增幅最大，達到了61.75%，其次是S.cerevisiae菌株第3d的增加量54.10%。隨著培養基中乙醇濃度的增加各菌株產酶量都受到了強烈的抑制，其中最強的是P.fermentans菌株，在10%和15%乙醇濃度下，甚至沒有β-葡萄糖苷酶的產生，而H.uvarum和S.cerevisiae菌株產酶量都顯著低于對照，且10%乙醇濃度對酶產生的抑制程度達到了90%以上。從酶學性質角度分析，高濃度醇對酶蛋白有一定的變性作用，從而導致酶活力的損失。本實驗中高濃度乙醇對酶產量的影響，是酶受乙醇的變性失活作用和酵母細胞產酶受抑制兩方面的綜合影響效果。在一定濃度乙醇存在條件下，H.uvarum菌株產酶量表現顯著高于S.cerevisiae菌株的特性，這將在一定程度上賦予其釀造條件下較好的應用前景。

表4　不同醇濃度對各菌株產酶情況的影響Table 4　Production of enzyme from different strains with different ethanol concentrations

3　討論

綜合糖、pH、醇三因子對各菌株產酶情況考察結果，可以得出各釀造因子對菌株的影響程度各不相同。pH實驗中，隨著pH的降低，所有菌株的產酶量都受到強烈的抑制。醇實驗中，在5%醇濃度下，一定時期內，參試菌株的產酶量都高于對照。乙醇雖然是一種脅迫因子，但在一定濃度范圍內，也是一種有效提高細胞通透性的試劑，低濃度條件下因為對細胞的傷害作用較小，相反在一定程度上卻提高了細胞膜的通透性，使得細胞內物質滲到胞外的量較正常情況有所增加，而表現出胞外發酵上清液中酶量的增加。但隨著濃度的升高，表現出對細胞生長、代謝的較強的抑制作用，以致P.fermentans菌株在高濃度乙醇存在條件下，已經檢測不到酶的產生[12]。

4　結論

β-葡萄糖苷酶在細胞中的定位情況顯示，三個菌株的β-葡萄糖苷酶都主要定位在胞內。總酶活最大的是H.uvarum菌株，達到了0.51U/mL，其次是S.cerevisiae菌株。高糖和低pH對各菌株產酶能力影響各不相同。H.uvarum菌株無論是在高糖還是對照條件下，分別以1.750U/mL和2.520U/mL的產酶量顯著高于其他菌株，且在最低pH3.0的條件下產酶量也顯著高于其他菌株，充分顯示出較強的應用潛能。在發酵前期，較低濃度乙醇（5%）對所有菌株的產酶量都有一定的促進作用，然而隨著乙醇濃度的升高，各菌株產酶量迅速下降，甚至沒有β-葡萄糖苷酶的產生（P.fermentans）。H.uvarum在對照、高糖以及低pH條件下，產酶量顯著高于其他菌株的較好表現，急需在進一步研究中進行考察，從而挖掘其釀造應用潛能。由于釀造因子單因子條件下，菌株產酶情況差異較大，因此需要在后期研究中進一步考察菌株在實際釀造條件下的產酶情況，以全面探索菌株的釀造特性，以及對釀造環境中結合態風味前體的釋放情況等。

[1]BergerRG.Advancesinbiochemicalengineering biotechnology：Biotechnology of aroma compounds[M].Berlin：Springer，1997.

[2]Abbott N A，Coombe B G，Williams P J.The contribution of hydrolyzed flavor precursors to quality differences in shiraz juice and wines-an investigation by sensory descriptive analysis[J]. AmericanJournalofEnologyandViticulture，1991，42（3）：167-174.

[3]Francis I，Sefton M，Williams P.A study by sensory descriptive analysis of the effects of oak origin，seasoning，and heating on the aromas of oak model wine extracts[J].American Journal of Enology and Viticulture，1992，43（1）：23.

[4]Barbagallo R N，Spagna G，Palmeri R，et al.Selection，characterization and comparison of β-glucosidase from mould and yeasts employable for enological applications[J].Enzyme and Microbial Technology，2004，35（1）：58-66.

[5]Liebig J，Wohler F.The composition of bitter almonds[J]. Annalen，1837，22（1）：1-24.

[6]Feldwisch J，Vente A，Zettl R，et al.Characterization of two membrane-associated β-glucosidases from maize（Zea mays L.）coleoptiles[J].Biochemical Journal，1994，302（Pt 1）：15.

[7]Palmeri R，Spagna G.β-Glucosidase in cellular and acellular formforwinemakingapplication[J].EnzymeandMicrobial Technology，2007，40（3）：382-389.

[8]Villena M A，Iranzo J F U＇，Pérez A I B.β-Glucosidase activity in wine yeasts：Application in enology[J].Enzyme and Microbial Technology，2007，40（3）：420-425.

[9]McMahon H，Zoecklein B，Fugelsang K，et al.Quantification of glycosidase activities in selected yeasts and lactic acid bacteria[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，1999，23（3）：198-203.

[10]Wang Y，Li J，Xu Y.Characterization of novel β-glucosidases with transglycosylation properties from Trichosporon asahii[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（20）：11219-11227.

[11]Faia A M，Ferreira A M，Climaco M C.The role of non-Saccharomyces species in releasing glycosidic bound fraction of grape aroma components-a preliminary study[J].Journal of Applied Microbiology，2001，91（1）：67-71.

[12]M Gra?a da Silveira M V S R，Maria C Loureiro-Dias，Frans M Rombouts，et al.Flow cytometric assessment of membrane integrity of ethanol-stressed Oenococcus oeni cells[J].Applied and Environmental Microbiology，2002，68（12）：6087-6093.

Effect of oenological factors on the productions of β-glucosidases from wild yeasts

WANG Yu-xia1，ZHANG Chao2，*
（1.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan，School of Life Science and Food Engineering，Institute for Bioengeering，Yibin University，Yibin 644000，China；2.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan，School of Life Science and Food Engineering，Institute for Food Science and Engineering，Yibin University，Yibin 644000，China）

The main objective of this study was to investigate the potential applications of wild yeast strains by assaying the enzyme production under simulated oenological conditions.The results indicated that most βglucosidases were intracellular activity.The highest total activity of H.uvarum was detected，0.51U/mL.A remarkable variability in the effects of oenological factors on the production of β-glucosidase were observed among yeast strains.The significant inhibitions on the β-glucosidase productions were observed under high sugar and low pH conditions.The strongest inhibition on P.fermentans was observed，for 63.50%～84.32%inhibition in comparion with control at pH 3.0，followed by Saccharomyces and Hanseniaspora.Furthermore，H.uvarum exhibited highest β-glucosidase production under the low pH conditions.Under the low concentration of alcohol（5%），the productions of yeast β-glucosidase were increased.But the β-glucosidases production decreased with increasing the concentration of alcohol，even no β-glucosidase activity could be detected for P.fermentans strain.In conclusion，the better performances endowed H.uvarum strain some potential application.

wine yeast；β-glucosidase；oenological factors

TS261.4

A

1002-0306（2014）14-0205-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.037

2014－01－06*通訊聯系人

王玉霞（1974-），女，博士，講師，研究方向：釀造工藝與微生物。

四川省教育廳重點項目（13ZA0197）；博士啟動項目（2012B17）；發酵與資源利用四川省重點實驗室開放基金重點項目（2011KFZ002）。