槲皮素異戊烯基修飾及清除自由基活性研究

李 梅，董華強，陳鏈杰，張英慧（佛山科學技術學院，食品與園藝學院，廣東佛山528231）

槲皮素異戊烯基修飾及清除自由基活性研究

李 梅，董華強，陳鏈杰，張英慧
（佛山科學技術學院，食品與園藝學院，廣東佛山528231）

目的：對槲皮素分子進行異戊烯化結構修飾，探索槲皮素異戊烯基修飾的最佳條件以及修飾產物的抗氧化活性。方法：以槲皮素、溴代異戊烯基為原料，采用威廉姆遜成醚法合成槲皮素異戊烯基修飾物，采用鄰苯三酚自氧化法、DPPH法、Fenton反應法檢測修飾產物體外對超氧陰離子自由基、DPPH自由基、羥自由基的清除作用。結果：槲皮素異戊烯基修飾的最佳反應條件為槲皮素與異戊烯基溴的比例為1∶1，在催化劑無水碳酸鉀的作用下，60℃水浴冷凝逆流反應8h，經柱層析分離獲得異戊烯基修飾物，HPLC檢測產物出峰時間較槲皮素晚，獲得的產物可能有兩種，峰面積為48.9%。槲皮素經異戊烯基化修飾后，所得產物對羥自由基的清除率顯著增加；低濃度時對超氧陰離子自由基的清除能力也增強，但對DPPH自由基的清除率低于槲皮素。結論：對槲皮素進行異戊烯基修飾，所得的異戊烯基修飾物是生物活性比槲皮素更高的新型活性化合物。

槲皮素，異戊烯化修飾，自由基，清除

自由基是人體正常代謝過程中的產物，具有高度的化學活性，可對機體產生毒害，生命活動的代謝過程中不斷產生各種氧自由基，是產生疾病的主要原因之一。從中草藥活性成分中尋找和開發具有較強清除自由基作用的低毒抗氧化劑已成為人們研究的熱點[1]。槲皮素（quercetin，3，3’，4’，5，7-五羥基黃酮，結構見圖1）是含量最為豐富的黃酮類化合物之一，具有廣泛的抗腫瘤、抗血小板、抗氧化等藥理作用，但該化合物含有多個極性基團羥基，親脂性弱，同時由于羥基在分子間形成氫鍵，晶格能較高，親水性也很差（槲皮素在水中溶解度為7μg/mL），導致其生物利用度低，大大限制了其臨床應用[2-5]，因此，槲皮素及其衍生物的合成及生物活性研究越來越受到人們的關注。近年來，學者們利用槲皮素分子中的活性基團——羥基，合成了一系列的槲皮素衍生物，期望改善槲皮素的藥物性能[6-9]。異戊烯黃酮類化合物是黃酮類化合物中獨特的一類。研究表明，異戊烯基的存在極大的增長了該類化合物的親脂性，使得化合物分子能夠強烈的親和生物膜，進而可引起相關生物活性的顯著提高[10-11]。對槲皮素進行異戊烯基修飾，可能會合成新的具有較高生物活性的物質。

本研究擬對槲皮素分子進行異戊烯化結構修飾，并對槲皮素及其異戊烯基化修飾物的抗氧化能力進行比較，為尋找新型、高效、低毒的槲皮素修飾物提供初步的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槲皮素（95%）、異戊烯基溴（90%） 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑 均為市售分析純。

2690高效液相色譜儀 美國Waters公司；722可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 槲皮素異戊烯基修飾物的冷凝逆流合成 利用異戊烯基溴取代槲皮素中某一位置的H原子，從而發生直接異戊烯基化的取代反應。合成路線如圖1所示[12]。

圖1 槲皮素異戊烯基修飾物合成路線圖Fig.1 Synthetic roadmap of quercetin isopentenyl modifier

按照以上路線圖，準確稱量（0.302g，1mmol）的槲皮素，50mL丙酮溶解，加入少量無水碳酸鉀（催化劑），0℃冰浴條件下加入與槲皮素相應摩爾比例（1∶1、1∶2、1∶3）的異戊烯溴丙酮溶液，振蕩均勻后，于58～62℃下冷凝逆流（密封、避光）4～16h，利用薄層層析法（TLC）跟蹤反應進程。反應完成后濾去碳酸鉀，用丙酮潤洗旋轉蒸發，蒸干產物用乙醚/乙酸乙酯萃取，濃縮，經柱層析分離（二氯甲烷∶乙酸乙酯=4∶1），得黃褐色固體，即槲皮素異戊烯基修飾物。用高效液相色譜法（色譜條件，色譜柱：C18（250nm×416nm，5滋m）反相液相色譜柱；流動相：甲醇（色譜純）；流速：1mL/min；檢測波長：360nm；柱溫：25℃；進樣量：10滋L。檢測器：UV）測定峰值，對比底物槲皮素與反應后的異戊烯基修飾產物的出峰時間和峰值差異。

1.2.2 槲皮素及其異戊烯基化修飾物抗氧化活性測定 以槲皮素為對照，研究不同濃度的槲皮素異戊烯基化修飾物對不同體系自由基的清除能力。

1.2.2.1 對羥自由基的清除作用 比色法測定Fenton反應生成的羥自由基，在各試管中加入不同濃度的槲皮素、槲皮素異戊烯基修飾物0.5mL，再依次加入9mmol/L Fe2+溶液0.5mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.5mL，最后加入9.1mmol/L H2O25mL啟動Fenton反應，搖勻后在510nm測量不同濃度下的吸光度為A1。取0.5mL蒸餾水取代9mmol/L Fe2+溶液測定吸光度為A2。取0.5mL蒸餾水代替不同濃度樣液測吸光度為A3。

1.2.2.2 對超氧陰離子自由基的清除作用 采用鄰苯三酚自氧化法測定不同濃度的槲皮素、槲皮素異戊烯基修飾物對超氧陰離子自由基的清除作用。于試管中加入相應試劑，25℃恒溫預熱20min，取混合液3mL于比色皿中加入45mmol/L鄰苯三酚（用0.01mol/L HCl配成）0.1mL，搖勻反應4min后在波長325nm處測定吸光度值，其中，A1為9mL pH8磷酸鹽緩沖液+1mL樣液+0.1mL 45mmol/L鄰苯三酚時的吸光度；A2為9mL pH8磷酸鹽緩沖液+1mL樣液時的吸光度；A3為9mL pH8磷酸鹽緩沖液+1mL蒸餾水+0.1mL 45mmol/L鄰苯三酚時的吸光度。

1.2.2.3 對DPPH自由基的清除作用 比色法測定槲皮素及其異戊烯基修飾物對DPPH·的清除作用：DPPH用95%乙醇配制0.0001mol/L溶液，于試管中加入相應試劑，25℃恒溫預熱30min，在波長517nm下測定吸光度。其中，A1為5mL DPPH溶液+0.5mL樣液時的吸光度；A2為5mL 95%的乙醇+0.5mL樣液時的吸光度；A3為5mL DPPH溶液+0.5mL蒸餾水的吸光度。

1.2.2.4 自由基清除率P（%）的計算 以上各體系測定所得的吸光度為A1、A2和A3代入以下公式，計算不同濃度的槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對不同體系自由基的清除能力。

1.3 數據處理

實驗數據利用Excel進行整理，利用DPS統計軟件進行統計分析。

圖2 反應物槲皮素色譜圖Fig.2 Chromatogram of reactants quercetin

2 結果與分析

2.1 槲皮素異戊烯基修飾物的合成

由于槲皮素分子中存在著五個羥基官能團，即存在多個反應位點，導致反應的選擇性差，合成的產物可能是單取代反應產物，也可能是多取代反應產物，將槲皮素與異戊烯基溴按（1∶2，1∶3）的比例于58～62℃下冷凝逆流反應4～16h后，發現反應產物經薄層層析法監測，斑點復雜，重現性差，意味著反應選擇性差，副產物多，而兩者按1∶1的比例合成時，TLC監測的斑點集中少數幾個點，且重現性較好，推測由于槲皮素分子結構中有5個羥基酸性各不相同，反應活性也不相同，在弱堿（K2CO3）存在條件下，可能是苷原上的酚羥基選擇性的連接異戊烯基，從而得到較高產率的單一或幾種衍生物。實驗還發現，槲皮素與異戊烯基溴1∶1的比例，有催化劑無水碳酸鉀作用條件下，在60℃水浴下反應8h后得槲皮素異戊烯基修飾產物的數量最多。該產物經柱層析分離，獲得純度較高的單取代異戊烯基修飾產物。

圖3 合成后產物色譜圖Fig.3 Chromatogram of synthetic product

由圖3可知，反應產物主要有兩種物質，保留時間分別為4.387min和4.782min，尤其是后一種產物的峰面積占48.9%。產物的保留時間比槲皮素的出峰時間1.877min晚2.51min和2.905min，可以得出：第一，保留時間不同，組分不同，兩種產物是不同于反應物槲皮素的新物質；第二，高效液相所用柱子為C18反相液相色譜柱，出峰時間越晚，極性越小，因此，可推測4.387min和4.782min出峰的新物質極性比1.877min出峰的反應物槲皮素極性小，符合產物特性。

2.2 槲皮素及其異戊烯基修飾物的抗氧化活性

2.2.1 槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對羥自由基的清除能力 羥基自由基是最活潑的自由基，也是毒性最大的自由基，它可與活細胞中的任何分子發生反應而造成損害，且反應速度快，能殺死紅細胞，降解DNA、細胞膜和多糖化合物，許多由它所致的有害效應在加入羥自由基的清除劑后會明顯降低，所以羥自由基清除率是評價物質對自由基的清除效果的最常用的指標之一。槲皮素是一種天然強氧化劑，大量研究表明，槲皮素的酯類衍生物和金屬配合物具有比槲皮素更強的抗氧化活性[13-14]。從圖4可知，槲皮素和異戊烯基修飾物都具有較強的清除羥基自由基的活性，隨著濃度的增大，兩者清除羥基自由基的活性均急劇增加，呈一定的量效關系。槲皮素異戊烯基修飾物的清除活性明顯強于槲皮素，樣液濃度同為40μmol/L時，異戊烯基修飾物對羥自由基的清除率已經達到87.41%，而槲皮素對羥自由基的清除率不足50%，說明對槲皮素進行異戊烯基修飾后，其對羥自由基的清除能力會大大提高。

圖4 槲皮素及其異戊烯基化修飾物對羥自由基的清除率Fig.4 Scawenging activities of quercetin and quercetin prenylation modification to·OH

2.2.2 槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對超氧陰離子自由基的清除能力 生物體內氧化還原反應中，大致有2%～5%的氧會產生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基的毒性是機體發生氧中毒的主要原因，表現在使核酸鏈斷裂、多糖解聚和不飽和脂肪酸過氧化作用，進而造成遺傳突變、膜損傷、酶系失活、線粒體氧化磷酸化作用改變等一系列變化。

圖5 槲皮素及其異戊烯基化修飾物對超氧陰離子的清除率Fig.5 Scawenging activities of quercetin and quercetin prenylation modification to O2-·

不同濃度的槲皮素及槲皮素異戊烯基修飾物對O2-·的清除率見圖5，槲皮素和槲皮素異戊烯基修飾物都具有較強的清除O2-·的作用，隨著濃度的增加，清除率也呈明顯上升趨勢，呈現量-效關系。在低濃度時（0.25～1.5μmol/L），槲皮素異戊烯基修飾物的清除率高于槲皮素（p＜0.05），在高濃度時（1.50～6.0μmol/L），槲皮素高于槲皮素異戊烯基修飾物（p＜0.05），這與對羥自由基的清除作用表現不同，槲皮素鉬配合物也有相似表現[15]，這可能是因為槲皮素及槲皮素異戊烯基修飾物對O2-·和·OH反應的活性部位和作用機制存在差異，具體的機理尚需進一步的研究。

圖6 槲皮素及其異戊烯基化修飾物對DPPH·的清除率Fig.6 Scawenging activities of quercetin and quercetin prenylation modification to DPPH·

2.2.3 槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對DPPH·的清除能力 DPPH·在有機溶劑中是一種穩定的自由基，在517nm處對光有較強的吸收，當有自由基消除劑存在時，其孤電子被配對，吸收消失或減弱。因此，可通過檢測自由基的清除情況，來評價某物質的氧化能力。自由基清除率越大，物質的抗氧化能力越強。

實驗結果表明（圖6），槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物均有較強的清除DPPH自由基的能力，且隨樣液濃度的增加而增加，相比，槲皮素對DPPH自由基的清除能力更強，但兩者無顯著差異，槲皮素進行異戊烯基修飾后，并不能增強其對DPPH自由基的清除活性。

2.3 槲皮素及其異戊烯基化修飾物對不同體系自由基清除率的比較

以清除自由基達到穩定態50%清除率所需加入槲皮素或槲皮素異戊烯基修飾物的量為IC50（μmol/L），用以表示其抗氧化能力。IC50值越小，達到50%自由基清除率所需的抗氧化劑越少，表明其抗氧化能力越強。從表1可以看出，槲皮素對超氧陰離子自由基的清除能力最強，其次是DPPH自由基，對羥自由基的清除能力最弱，經異戊烯基修飾后，產物對羥自由基的IC50為15.27μmol/L，遠小于槲皮素的39.53μmol/L，低濃度時，異戊烯基修飾物對超氧陰離子自由基的清除能力也較槲皮素更強，但對DPPH·的清除能力較槲皮素減弱，具體原因尚待進一步的研究。

表1 槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物體外清除自由基IC50（μmol/L）Table 1 Quercetin and quercetin isopentenyl modification to different free radicals scavenging IC50（μmol/L）

3 結論

3.1 本實驗對槲皮素分子進行異戊烯化結構修飾，探索出槲皮素異戊烯基修飾產物的最佳條件：槲皮素反應物與異戊烯基溴的比例為1∶1，在催化劑無水碳酸鉀的作用下，60℃水浴冷凝逆流反應8h。經柱層析分離可獲得純度較高，可能包含兩種成分的異戊烯基修飾物。

3.2 槲皮素具有較強的體外抗氧化活性，對其結構進行異戊烯基化修飾，所得的異戊烯基化修飾物的體外抗氧化活性會顯著增強，表現為對羥自由基的清除率較槲皮素顯著增加；低濃度時對超氧陰離子自由基的清除能力也較槲皮素強，但對DPPH自由基的清除率低于槲皮素。

3.3 對槲皮素進行異戊烯基修飾，獲得的槲皮素異戊烯基修飾物可能是生物活性比槲皮素更高的新型活性化合物，具體合成產物的結構及其食用和藥用價值有待進一步的研究。

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Study on quercetin isopentenyl modification and free radical scavenging activity

LI Mei，DONG Hua-qiang，CHEN Lian-jie，ZHANG Ying-hui
（College of Food and Horticulture，Foshan University，Foshan 528231，China）

Objective：The best conditions of synthesizing quercetin isopentenyl modifier and the antioxidant activity of modified products were discovered.Methods：The Williamson forming ether method was adopted to synthesizing quercetin isopentenyl modifier with quercetin and prenyl bromide as raw reactants.Moreover，the scavenging effects of modified products in vitro on superoxide anion（by pyrogallol autoxidation method），DPPH radical and hydroxyl radicals（by Fenton reaction method）were evaluated.Results：The optimal reaction conditions to synthesize quercetin modifier were quercetin and prenyl bromide ratio of 1∶1，the catalyst role of anhydrous potassium carbonate，60℃ water bath reflux condensation reaction 8h，separated by column chromatography to obtain modifications.HPLC retention times of the product detected later than quercetin，the product obtained may have two，peak area 48.9%.Quercetin by isopentenyl modification，the resulting products on hydroxyl radical and superoxide anion scavenging rate was significantly increased，but the removal of the DPPH radical was lower than that of quercetin.Conclusion：After quercetin was modified by isopentenyl，the resulting product was a new active compounds which have higher biological activity than quercetin.

quercetin；prenylation modification；free radicals；scavenging

TS201.2

A

1002-0306（2014）14-0084-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.009

2013－09－24

李梅（1973-），女，副教授，研究方向：食品安全。

國家自然科學基金項目（31071537）；佛山科學技術學院校級重點課題。