白色鏈霉菌發酵ε-Polylysine動力學研究

張建國，錢會芳，陳曉明（西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621010）

白色鏈霉菌發酵ε-Polylysine動力學研究

張建國，錢會芳，陳曉明
（西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621010）

利用白色鏈霉菌（Streptomyces Albus KD-11）為出發菌株在30L全自動發酵罐中進行ε-PL分批發酵動力學研究。基于Logistic方程、Luedeking-Piret方程、類似Luedeking-Piret方程建立了Streptomyces Albus KD-11菌體生長、ε-PL產物合成和底物葡萄糖消耗的動力學模型。利用Origin 8.1軟件對模型參數進行非線性擬合，建立的模型擬合程度R2均大于0.980，擬合良好。當葡萄糖初始濃度在45～55g/L范圍內，實驗數據與模型預測值平均相對誤差小于8%，適用性良好。表明該動力學模型對指導ε-PL的發酵工藝優化具有指導意義。

白色鏈霉菌，分批發酵，動力學，ε-聚賴氨酸

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是L-賴氨酸同型聚合物，由L-賴氨酸間ε-酰胺連接而成的[1]。ε-PL酸性條件下高溫加熱后仍具有廣譜抑菌活性及體內降解產物對人體有益無害[2-3]，于是2003年美國FDA允許其作為食品添加劑，其后ε-PL在食品防腐領域得到廣泛應用[4-5]。目前，日本建立了ε-聚賴氨酸的生產線，我國還處于實驗室階段[6]。因此，研究ε-聚賴氨酸發酵動力學對指導生產技術具有重要經濟意義。

發酵動力學模型的研究可將微觀現象和宏觀現象相關聯，可以用來發現未知變量的重要性，尋找被忽略或未發現的重要影響參數[7]。白色鏈霉菌屬是目前ε-PL進行液態深層發酵的主要種屬，由于缺乏對其胞內代謝調控的微觀認識，其發酵過程控制還處于半經驗狀態。因此，發現和確定重要影響因素對其宏觀控制有著直接的指導意義，并對微觀研究提供線索。

發酵動力學模型具有一定的專一性，不同的菌株不同的發酵條件即使生產相同的產物其模型都是不同的。本研究適當調整白色鏈霉菌KD-11合成ε-PL的最優配方[8]，在30L發酵罐上研究ε-PL生產動力學過程，為進一步工藝優化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白色鏈霉菌（Streptomyces AlbusKD-11） 本實驗室篩選保存。

BIOTECH-30BSG型30L全自動發酵罐 上海寶興生物設備有限公司；萬分之一天平 北京賽多利斯系統有限公司；7200分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；全溫振蕩培養箱 哈爾濱東聯電子公司。

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基（g·L-1） 葡萄糖10，酵母浸膏1，蛋白陳2，瓊脂15，pH7.0～7.2，1×105Pa滅菌25min。

1.2.2 種子培養基（g·L-1） 葡萄糖10，酵母粉4，蛋白胨1，pH6.8，1×105Pa滅菌30min。

1.2.3 發酵培養基（g·L-1） 葡萄糖50，K2HPO41.500，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.03，FeSO4·7H2O 0.04，KH2PO41.00，（NH4）2SO48.572，酵母粉5.00，pH6.8，1×105Pa滅菌30min，酵母粉與（NH4）2SO4單獨滅菌。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養方法

1.3.1.1 種子培養 將活化的斜面白色鏈霉菌單孢子菌落接種至含有100mL種子培養基的300mL三角瓶中，200r·min-1，30℃，搖床振蕩培養48h左右。

1.3.1.2 分批發酵 將5%接種量的種子培養液無菌接入含有20L發酵培養基的30L-全自動發酵罐中，30℃，攪拌轉速為150r·min-1，通氣量為0.8（VVM），培養72h，發酵過程記錄pH、溶氧（DO）變化。

1.3.2 ε-PL濃度測定-Itzhaki法[9]取發酵液離心所得的上清稀釋液2mL與2mL 1mmol·L-1甲基橙水溶液，在試管中混合后，30℃下振蕩反應40min。反應結束后，8000r·min-1離心10min，取離心上清液稀釋適當倍數于465nm處測OD值，由標準曲線算出ε-聚賴氨酸的含量。

1.3.3 菌體濃度測定方法-干重法 取5～20mL發酵液6000r·min-1離心10min，棄上清液，再加去離子水懸浮、離心2次，獲沉淀放入干燥潔凈已知重量的培養皿中，80℃的烘箱內烘干至恒重，稱重，計算，得知菌體干重濃度（Dry cell weigh，DCW）。

1.3.4 殘糖濃度（Residual glucose，RG）測定-采用DNS法[10]取離心后上清液，進行適當稀釋，采用3，5-二硝基水楊酸法測定發酵液中還原糖濃度。

1.4 數據處理

發酵過程參數非線性擬合和檢驗采用Origin 8.1軟件分析[11]。

2 結果與分析

2.1 ε-PL分批發酵過程特征

圖1為白色鏈霉菌分批發酵ε-PL過程曲線，顯示了菌體濃度（DCW）、殘糖濃度（RG）、ε-PL產物濃度、溶解氧濃度（DO）以及pH隨時間t的變化趨勢。從圖1可知，菌體經過8h左右的延遲期進入對數生長期，葡萄糖消耗加快、溶解氧濃度迅速下降處于20%以下達到40h，pH逐步下降。48h時菌體生長進入穩定期，菌體濃度增長幅度銳減，達到6.8231g·L-1時不再增加，pH下降幅度加快，下降至3.21，與此同時ε-PL合成速度加快，發酵終了ε-PL濃度達到ε-PL 1.82g·L-1、殘糖濃度為14.89g·L-1。根據產物ε-PL形成與菌體生長的關系可以判斷產物ε-PL形成與菌體生長呈部分生長關聯型。發酵過程中隨菌體增值速度和濃度增加，需氧量增大，造成溶解氧降低，與此同時由于殘糖濃度較高不能充分氧化分解形成酸類小分子物質致使pH降低，同時培養基中生理酸性鹽（NH4）2SO4的利用也是pH降低的原因；從發酵過程中pH變化趨勢可看出在3.6～4.4之間ε-PL分泌速度最快與Kahar P等發現白色鏈霉菌發酵生產ε-PL時，在pH4左右大量積累而pH在5～8時ε-PL積累很少[12]相吻合。

圖1 白色鏈霉菌產ε-聚賴氨酸分批發酵過程Fig.1 Profile of ε-PL batch fermentation by Streptomyces Albus KD-11

2.2 ε-PL分批發酵動力學模型與檢驗

2.2.1 菌體生長動力學模型 通過圖1可以看出菌體的生長曲線呈S型，故利用Verhulst-Pearl提出的邏輯方程（Logistic equations），模擬白色鏈霉菌（Streptomyces AlbusKD-11）的發酵過程。定義比生長速率μ如下：

式中，μmax為最大比生長速率（h-1），Cx為細胞濃度（g·L-1），Cx，max為最大細胞濃度（g·L-1）。

則菌體生長動力學方程為：

式中，t為發酵時間（h），對式（2）進行積分得，

式中，Cx，0為初始時細胞濃度（g·L-1），將圖1數據代入式（3）進行非線性擬合獲得生長動力參數Cx，0，Cx，max，μmax值分別為0.242、0.680、0.149，代入式（3）獲得菌體生長動力學方程。

由Logistic方程獲得的式（4）預測的模型值與實驗數據進行對比驗證，結果見圖2。

圖2 白色鏈霉菌生長模型值與實驗值比較Fig.2 Comparison of kinetic model with DCW date for Streptomyces Albus KD-11

從圖2可以看出，菌體生長模型預測值和實驗值之間能夠較好的吻合，經檢驗其相關系數為R2=0.996。Logistic方程常用來構建菌體對自身生長有抑制作用的菌體生長模型，常用于分批發酵過程[12-13]，表明該菌體的生長受到自身的影響。

2.2.2 ε-PL生成動力學模型 Gaden根據產物形成與菌體生長的關系將產物的合成分為3類：a.產物生產與菌體生長相耦聯，b.產物生產與菌體生長部分耦聯，c.產物的形成與菌體的生長沒有關系[7]。圖1可以看出ε-PL的產物發酵與菌體生長部分耦聯，故采用Luedeking-Piret方程描述胞ε-poly-lys的生成速率為：

式中，Cp為ε-PL（g·L-1），α為與菌體生長相關聯的產物生成常數（g產物·（g細胞）-1），β為與菌體濃度相關聯的產物生成常數（g產物·（g細胞·h）-1），將式（2）和式（3）代入式（5），進行積分可得式（6）。

將菌體生長動力參數Cx，0，Cx，max，μmax分別代入式（6）利用圖1的實驗數據進行非線性擬合得到產物形成動力學參數α、β值分別為0.28011、0.000217，代入式（6）獲得產物濃度與時間的關系式，見式（7）。

由Luedeking-Piret方程獲得的式（7）預測模型值與實驗數據進行對比驗證，結果見圖3。

圖3 ε-PL生成模型值與實驗值比較Fig.3 Comparison of kinetic model with ε-PL production date for Streptomyces Albus KD-11

從圖3可以看出，ε-PL生成模型值和實驗值之間能夠較好的吻合，經檢驗其相關系數為R2=0.980。

2.2.3 底物消耗動力學模型 ε-PL分批發酵過程中，底物碳源，一部分用于細胞生長，一部分合成產物，一部分用于能量消耗以維持細胞生命之用[7]。ε-PL的合成與菌體生長關系從圖1初步判斷為部分生長關聯型，擬用Luedeking-Piret相似的方程式來表示基質消耗。

式中，Cs為葡萄糖濃度（g·L-1），α為與菌體生長相關聯的產物生成常數（g產物·（g細胞）-1），β為與菌體濃度相關聯的產物生成常數（g產物·（g細胞·h）-1），YG為用于菌體生長的碳源得率系數（g細胞·（g葡萄糖）-1），Yp/s為產物對底物的得率系數（g葡萄糖·（gε-PL）-1），m為菌體維持系數（[g葡萄糖·（g細胞·h）-1），發酵過程中碳源主要用于菌體生長和維持活性，用于產物形成的消耗的葡萄糖部分可以忽略不計，式（8）可簡化如下。

對式（9）進行積分得到：

將菌體生長動力參數Cx，0，Cx，max，μmax分別代入式（10）利用圖1的實驗數據進行非線性擬合得到產物形成動力學參數m、YG值分別為0.04771、0.35039代入式（10）得產物濃度與時間的關系式，如式（11）所示。

對上述建立的動力學方程與實驗數據進行對比擬合結果見圖4，圖4表明式（11）用于描述底物消耗相關系數R2為0.986，可以較好的對白色鏈霉菌（Streptomyces AlbusKD-11）底物消耗動力學進行描述，說明所采用的假設機理和方程簡化是可行的。

圖4 殘糖濃度模型值與實驗值比較Fig.4 Comparison of kinetic model with residual glucose concentration date for Streptomyces Albus KD-11

2.3 模型適用性考察

上述模型的參數求取過程中是以初始菌體濃度為（0.2012±0.5）g·L-1和初始葡萄糖濃度為（48±1）g·L-1的基礎上建立的。為了考察該模型的適用條件，為此選擇初始葡糖糖濃度分別為（45±1）、（55±1）g·L-1初始菌體濃度均控制在（0.2012±0.5）g·L-1范圍其余條件與建立模型時相同，結果見圖5，從圖5中可以看出在初始葡萄濃度在45～55g·L-1該模型都能較好的預測，該模型預測菌體生長、底物消耗和產物形成與實驗值平均誤差在分別為5%、4%、8%。

圖5 不同初始葡萄糖濃度條件下實驗值與模型值的比較Fig.5 Comparison of kinetic model with experimental data of Streptomyces Albus KD-11 under various concentration of glucose in the batch fernentation

3 結論

3.1 ε-PL生成與Streptomyces Albus KD-11生長呈部分生長關聯型，菌體生長、ε-PL生成以及葡萄糖的消耗分別適合用Logistic方程、Luedeking Piret方程，類似Luedekin Piret方程予以描述。

3.2 所建立的模型能較好的反映Streptomyces Albus KD-11產ε-PL發酵過程，在初始菌體濃度為（0.2012± 0.5）g·L-1條件下，初糖濃度在45～55g·L-1之間也適合利用該模型對其發酵過程進行預測，為該模型的使用提供了邊界條件。

3.3 該模型能為進一步對Streptomyces Albus KD-11發酵生產ε-PL的工藝條件優化、發酵方式改進、菌種選育的評價等進一步研究工作提供依據。

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Batch fermentation kinetics of ε-Polylysine by Streptomyces Albus KD-11

ZHANG Jian-guo，QIAN Hui-fang，CHEN Xiao-ming
（School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China）

The kinetic models of the batch fermentation of ε-PL by Streptomyces Albus KD-11 in a 30L-bioreactor were studied.The kinetics model was proposed by using the Logistic equation for cell growth，the Luedeking Piret equation for ε-PL production and the Luedeking-Piret-like equation for consumption of glucose as substrate.Parameters were gained with nonlinear curve fit by Origin 8.1 version.The goodness-of-fit scores R2of models are all greater than 0.980 showed good agreement of predicted values with the experimental values. Calculated results of models were compared satisfactorily with experimental data under various initial glucose concentrations（45～55g/L），the average relative error was no more than 8%.The kinetic model had guiding process in ε-PL fermentation of Streptomyces Albus KD-11.

Streptomyces Albus；batch fermentation；kinetics model；ε-Polylysine

TS202.3

A

1002-0306（2014）12-0222-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.040

2013－09－24

張建國（1973-），男，碩士研究生，講師，研究方向：發酵工程。基金項目：西南科技大學青年基金（07zx3125）。