即食海蜇中特定腐敗菌的分離及PCR檢測

婁永江，柳 麗（寧波大學海洋學院，浙江寧波315211）

即食海蜇中特定腐敗菌的分離及PCR檢測

婁永江，柳 麗
（寧波大學海洋學院，浙江寧波315211）

利用傳統的微生物檢測方法及PCR技術快速檢測即食海蜇中的優勢腐敗菌，檢測結果顯示：PCR檢測與傳統方法鑒定出的結果一致，即食海蜇的特定腐敗菌為芽孢桿菌、假單胞菌以及腐敗希瓦氏菌。

PCR技術，即食海蜇，特定腐敗菌

即食海蜇是一種低脂肪、高蛋白的食品，深受廣大消費者的喜愛，因此也成為眾多學者研究的一個方向[1-5]。由于這種海產品含水量高、營養好，容易發生腐敗變質，而微生物則是引發產品腐敗變質的主要原因。因此，探索導致即食海蜇變質的微生物種類，才能有效地對產品的品質進行監控，這也是提高即食海蜇產品質量的前提。因微生物種類繁多，國外學者通過對水產品中腐敗微生物進行的長期研究，提出來特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）[6]的概念。

一直以來，微生物的鑒定都是采取傳統的方式：通過培養基對菌種進行分離純化培養，之后從形態學、生理生化反應特征等進行菌種鑒定[7]，這個過程費時費力，而且結果的準確性受到了諸多因素的影響[8]。近年來隨著分子技術的發展，利用分子生物學技術來解決微生物分類鑒定變得簡單易行，現在比較常見的是利用PCR技術快速鑒定菌種。PCR技術[9-10]即是聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction），于20世紀90年代美國學者研究提出，此技術已被廣大學者運用研究。目前，國內外還暫未發現有人將PCR技術運用到即食海蜇的研究上。本實驗主要利用傳統方法及PCR技術檢測即食海蜇中的特定腐敗菌，為研究即食海蜇制品的貯藏保鮮提供基礎。

1 材料與方法

即食海蜇 寧波市天峰水產有限公司；平板計數瓊脂（PAC）培養基 青島海博生物公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker、10×PCR Buffer、dNTP、DNA聚合酶Taq、MgCl2、超純水、引物27F、1492R等 上海捷瑞生物工程有限公司。

TY10TC-512型PCR擴增儀 英國TECHNE；MP2000D型電子天平 上海實驗儀器總廠；BCD-256H型冰箱 海爾集團；W-CJ-IB型凈化工作臺 蘇州凈化設備廠；HH-4型數顯恒溫水浴鍋 上海實驗儀器廠；150A型生化培養箱 江蘇環宇科學儀器廠；DYY-6C型穩流穩壓電泳儀 南京惠普生物公司；Champgel 6000型凝膠成像儀 美國BIO公司；YM100Z型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的分離純化實驗 在無菌條件下，取貯存期為200d、已明顯腐敗的即食海蜇制品，稱取即食海蜇及溶液100g，用無菌研缽搗碎后準確稱取25g，加入到225mL的無菌蛋白胨溶液（內含10g的無菌玻璃珠），充分振蕩15min后取1mL上清液，進行1∶10梯度實驗稀釋。選取10-5濃度的溶液，分別放置在培養基上進行微生物涂布培養。根據生食水產品常含細菌的種類，挑選合適的培養基，充分培養出即食海蜇中含有的細菌種類，所挑選培養基如下：

表1 幾種常見水產品菌的選擇培養基及培養條件Table 1 Culture media and culture conditions of several common aquatic bacteria

利用不同的選擇培養基對即食海蜇所含菌進行培養，挑選相應菌種的典型生長菌落，在平板培養基上反復進行劃線分離培養，直至得到純化的單菌落。之后利用伯杰氏系統細菌學手冊[11]，對于得到的單個菌落進行菌落特征和菌體形態的鑒定。

1.2.2 細菌的生理生化實驗測定 依據細菌的一般常用鑒定方法[12]，對所得的菌落進行過氧化氫酶實驗、氧化酶實驗、葡萄糖氧化發酵實驗、精氨酸雙水解酶實驗、V-P（乙酰甲基甲醇）實驗、MR（甲基紅）實驗。

1.2.3 即食海蜇細菌DNA的提取 利用QIAGEN公司提取基因組DNA試劑盒直接提取DAN。

1.2.4 PCR擴增 在PCR擴增中，選用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以1.2.3中提取的基因組DNA為模板，選擇50μL反應體系進行PCR擴增。

3.選擇一個合適的地方進行交流也很重要。基羅斯建議家長選擇安靜的房間以避免被打擾。如果在談話中就某些問題達成一致，就讓孩子寫在紙上，并放在一個顯眼的位置，以約束雙方共同遵守。

本文中PCR反應體系的組成為：引物各1.0μL，10×PCR Buffer 5.0μL，模版DNA 1.0μL，DNA Taq聚合酶0.4μL，MgCl25.0μL，dNTP 8.0μL，超純水28.6μL。

PCR反應的步驟：首先94℃預變性5min，之后有個30個步驟的循環，這個循環的程序是94℃變性50s，52℃退火50s，72℃延伸80s。這30個循環結束之后，72℃最終延伸10min。

PCR結束之后，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測擴增效果。

1.2.5 DNA測序 在凝膠成像系統中觀看PCR擴增結果，檢測擴增是否成功。對于成功的亮帶，利用回收試劑盒回收純化PCR擴增產物，送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將上海生工生物工程技術服務有限公司反饋的序列結果，與GeneBank中核酸數據（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行對比分析，選擇相似性高于97%的菌屬，再將PCR分析結果與傳統微生物分析的結果對比，看其二者之間的差異與共同性。

表2 即食海蜇分離出的菌株形態及特征Table 2 Characteristics of strains isolated from ready-to-eat jellyfish

表3 即食海蜇中各類腐敗菌的生理生化實驗結果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of spoilage bacteria from ready-to-eat jellyfish

2 結果與分析

2.1 分離純化后細菌的菌體形態和菌落特征

對所獲細菌進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察所獲得的菌體在培養基上的菌落以及它的菌體形態，如表2所示。

2.2 細菌生理生化實驗

根據菌種的細菌形態以及菌落特征，結合各種生理生化實驗結果的鑒定，再查閱《常見細菌系統鑒定手冊》，可以鑒定出A5、G3、I9是芽孢桿菌屬，G5、I3是腐敗希瓦氏菌，F3是假單胞菌。

2.3 PCR擴增結果分析

利用基因組提取試劑盒提取A5、F3、G5、G3、I3、I9的DNA，利用PCR擴增儀擴增其DNA片段，擴增結果于做凝膠成像系統分析拍照，結果如圖1所示。實驗結果顯示，擴增的6個樣品中，都獲得了長度約在1600kbp左右的亮帶，證明了本次實驗獲得的PCR擴增產物是實驗菌株樣品的16S rDNA的基因片段。

圖1 PCR擴增結果Fig.1 The amplification results of PCR

2.4 基因序列對比分析

用回收試劑盒將PCR擴增的結果亮帶進行切膠回收，回收物交于上海生工進行分析序列。在GenBank數據庫里，將所得的16S rDNA序列進行Blast分析，選取相似度高于97%的菌株。將分析結果與傳統的實驗方法的鑒定結果進行對比，比較兩者檢驗結果是否一致。

表4 16S rDNA序列對比分析及與傳統檢測方法對比Table 4 The results of comparative analysis about 16S rDNA and traditional detection methods

通過表4分析可知，F3與假單胞菌的同源性最高，為100%相似，其次A5、G3、I9與芽孢桿菌同源性最高，達到了99%，G5、I3與腐敗希瓦氏菌的同源性最高，達到了98%。研究結果表明，即食海蜇的優勢腐敗菌為芽孢桿菌、假單胞菌以及腐敗希瓦氏菌，這與傳統方法鑒定出的結果一致。

3 結論

在本實驗中，從即食海蜇中分離出來6種菌株，經過傳統微生物鑒別如菌體特征、菌落形態、生理生化實驗以及PCR擴增分子生物法分析，鑒定這6種菌株分別是假單胞菌、腐敗希瓦氏菌以及芽孢桿菌，傳統檢測方法與PCR檢測結果一致，為以后即食海蜇的保鮮技術提供了依據。

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Specific spoilage organism of instant jellyfish’s isolation and PCR technique

LOU Yong-jiang，LIU LI
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

The conventional microbiological detection methods and PCR techniques was used to determine rapidly the specific spoilage organism of instant jellyfish.The results showed that：the identification consequence of PCR and traditional method was consistency，and the specific spoilage organism of instant jellyfish was Bacillus，Pseudomonas and corruption Shewanella.

PCR technique；instant jellyfish；the specific spoilage organism

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0207-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.036

2013－09－11

婁永江（1965-），男，碩士研究生，研究方向：水產品加工及質量安全控制。

寧波大學大學生科研創新計劃項目（2011SRIP005）資助。