川西北牧區傳統發酵牦牛酸奶中發酵畢赤酵母菌的分離鑒定

王遠微，張誠民，索化夷，岳 華，李 鍵，湯 承，*（.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都6004；.西南大學食品科學學院，重慶40075）

川西北牧區傳統發酵牦牛酸奶中發酵畢赤酵母菌的分離鑒定

王遠微1，張誠民1，索化夷2，岳 華1，李 鍵1，湯 承1，*
（1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041；
2.西南大學食品科學學院，重慶400715）

對川西北部分牧區的10份傳統發酵牦牛酸奶樣品進行酵母菌的分離，通過常規形態特征和26S rRNA基因測序分析鑒定出6株發酵畢赤酵母菌（Pichia fermentans）。同源性分析顯示6株分離菌與已知發酵畢赤酵母菌的同源性高達99.7%～100%。實驗結果為該地區傳統發酵牦牛酸奶中微生物組成多樣性研究以及發酵畢赤酵母菌遺傳多樣性研究提供參考。

傳統發酵牦牛酸奶，發酵畢赤酵母菌，分離鑒定

傳統發酵牦牛酸奶是青藏高原地區牧民采用傳統方法制作而成，營養價值很高，蛋白質和脂肪含量分別達到4.91%和6.89%[1-4]，且含有大量的揮發性脂肪酸[5]，并富有良好的風味。其在維持腸道菌群生態平衡、促進腸道蠕動、促進消化、抗衰老、抗癌、提高人體免疫力等方面有很好的效果[6]。它是牧區非常傳統的奶制食品，也是牧民重要的經濟收入來源。

牦牛酸奶發酵過程受海拔地理環境、氣候環境、發酵溫度、發酵時間、制作方法、文化及奶源的影響，因此微生物菌群非常復雜。張和平等[3]報道青海西北部的高原牦牛酸奶和青海東部的環湖牦牛酸奶中乳酸菌是優勢菌，而青海南部的環湖牦牛酸奶中酵母菌是優勢菌。Xiao-He Wu等[4]發現3種乳酸菌以及5種酵母菌是西藏不同海拔地區牦牛酸奶中主要的發酵菌群，其中發酵乳桿菌是優勢菌。Koichi[7]等發現蒙古牦牛酸奶中乳酸菌量明顯高于酵母菌的量。牦牛酸奶中的微生物菌群盡管比較復雜，但其主要組成是乳酸菌和酵母菌[8]，只是不同地區優勢菌的種類不同。隨著對傳統發酵乳制品中酵母菌研究的深入，越來越多的酵母菌種屬在各種乳制品中被檢測出來。發酵畢赤酵母也是其中之一，在開菲爾酸奶、中國酸馬奶、西藏的曲拉、臺北的酸奶中都相繼發現了該菌[9-12]。張和平和闞建全、Mei Bai等[13]也分別從青海地區和西藏地區傳統發酵牦牛酸奶中發現該菌，其中張和平等發現青海地區牦牛酸奶中發酵畢赤酵母的分離率達到43.2%，是青海地區酸牦牛奶中的優勢菌。但對于川西北高原牧區傳統發酵牦牛酸奶中的發酵畢赤酵母的分離報道比較少。

本研究對川西北地區的紅原、若爾蓋、康定等地的10份傳統發酵牦牛酸奶樣品進行酵母菌的分離鑒定，并對分離菌進行了系統進化分析，以期對川西北高原地區傳統發酵牦牛酸奶中蘊含的大量原始微生物菌種資源的保護及研究提供菌株，為該地區傳統發酵牦牛酸奶中微生物組成多樣性研究和發酵畢赤酵母的遺傳多樣性研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品采集及儲存運輸 樣本采自川西北地區的四川省阿壩洲紅原縣（3份）、若爾蓋縣（3份）和甘孜州康定縣（4份），樣本置于4℃樣品箱運輸到實驗室，立即進行分離培養；YPD培養基、革蘭氏染液 杭州微生物制劑有限公司；Taq DNA聚合酶、PCR試劑、DNA Markers、dNTPs 購自TaKaRa公司；瓊脂糖 Oxoid公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 TIANGEN公司；AXY prepTM DNA Gel extraction kitAXYGEN公司；

恒溫培養箱 上海齊欣公司；centrifuge 5804高速離心機 德國Eppendorf公司；my cyclerTMPCR儀、核酸電泳儀powerpac universalTM、VerSa Doc2000凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；Milli-Q超純水儀 法國Millipore公司；移液器 德國Eppendorf公司；LD2X-30KA立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；HR40-ⅡA2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；AR2130/C精密電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化 分別吸取1mL牦牛酸奶置于裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩使其混勻。將混合后牦牛酸奶進行倍比稀釋，稀釋度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，選取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75個稀釋度，用移液器吸取1mL樣液，采用涂布法，將樣液均勻涂布于YPD培養基上，將制備好平板置于28℃恒溫培養箱中培養24～48h，觀察并記錄菌落特征，挑取菌落較大，且呈白色或乳白色的單個菌落進行革蘭氏染色，觀察細胞形態，呈圓形或橢圓形、臘腸狀且細胞較大者，將其再接種于YPD培養基，于28℃恒溫培養箱中培養24～48h，重復幾次純化酵母菌，直至鏡檢結果為同一細胞形態后，將其接種于YPD液體培養基中，于28℃恒溫培養24～48h后，加入30%的滅菌甘油，混勻后置于-80℃保存備用。

1.2.2 形態結構觀察 將上述純培養菌，接種于YPD培養基斜面，置28℃恒溫培養18h后涂片，經革蘭氏染色后鏡檢細菌形態。

1.2.3 酵母菌的26S rRNA序列測定與系統發育學分析

1.2.3.1 PCR模板DNA的制備 將上述純化的酵母菌接種于YPD液體培養基中置于28℃振蕩培養24h，取培養液按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取細菌基因組DNA，作為本實驗的PCR模板。

1.2.3.2 PCR引物 PCR擴增目的片段在酵母菌的大亞基26S rRNA的D1/D2可變區域內，引物序列為NL-1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’、NL-4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’[14]，擴增的目的片段大小在500～600bp之間，引物由上海生工合成。

1.2.3.3 PCR方法 PCR反應采用25μL反應體系，其中含DNA模板1μL，上下游引物各1μL（10pmol），4× dNTPs（10mmol/L）2μL，Taq酶（5U/μL）0.125μL，Mg2+3μL（10mol/mL），10×PCR buffer 2.5μL，用超純水補足至25μL。PCR程序如下：95°C預變性5min，94℃1min，52℃1min，72℃1.5min，36個循環，再72℃溫浴10min，降至室溫后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3.4 目的片段的純化回收及測序 按照1.2.3.3的反應體系和反應條件擴增100μL PCR產物，2%瓊脂糖凝膠電泳后按照AXYGEN膠回收試劑盒操作說明進行目的片段的純化回收，回收后再2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將電泳檢測后的回收產物送上海生工進行測序。

1.2.3.5 序列分析與系統發生樹構建 將上述測序得到的26S rRNA基因序列通過NCBI的Blast檢索系統（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）進行序列同源性分析，選擇同源性大于99%的10個酵母序列的片段，同時調取GenBank數據庫中收錄的克魯維菌屬的18個種的32株酵母的相同區段基因序列，使用ClustalX1.83軟件進行多序列匹配比對（Multiple Alignments），通過Mega4.1軟件采用neighbor-joining法構建分離酵母的同源序列系統進化樹和克魯維酵母屬內系統進化樹，采用自舉分析（Boot strap）進行置信度檢測，自舉數據集為3000次。

2 結果與分析

2.1 酵母菌分離菌株的菌落形態及細胞形態特征

從四川紅原、若爾蓋、康定等地的10份傳統發酵牦牛酸奶樣品中分離到的6個酵母分離株，菌落形態呈圓形，表面光滑濕潤，顏色呈乳白色，表面凸起，邊緣整齊，不透明。顯微鏡下細胞染色為藍紫色，形態為圓、橢圓、卵圓等，無性繁殖為芽殖，一端出芽，細胞形態符合酵母菌特征，見圖1。

圖1 分離菌的細胞形態（1000×）Fig.1 Cell morphology of isolates（1000×）

2.2 酵母菌26S rRNA序列PCR擴增結果

按照PCR反應條件進行擴增，經瓊脂糖電泳檢測結果顯示酵母26S rRNA基因PCR擴增產物在約587bp左右處出現一條明亮的條帶，與預期片段大小相符，證明PCR擴增正確，見圖2。

2.3 酵母菌26S rRNA基因測序同源比對及系統發育分析結果

經26S rRNA基因序列測定，擴增序列長度為586～ 588bp，與Genbank中同源性較高的菌株進行同源性比對。結果顯示分離的6株酵母菌與Genbank中發酵畢赤酵母的同源性最高，相似性為99.7%～100%，見圖3。

系統發育分析顯示，6株分離酵母菌與Genbank中的發酵畢赤酵母菌序列獨立于畢赤酵母屬的其他種酵母形成一個大的分支，發酵畢赤酵母菌大分支中形成3個小的分支，6株分離酵母菌分列其中兩個小的分支中，見圖4。

圖2 分離菌的26S rRNA基因的PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification of 26S rRNA gene of isolates

圖3 分離株與發酵畢赤酵母的26S rRNA基因序列的同源性比較結果Fig.3 Sequence homology comparison of 26S rRNA gene sequences of Pichia fermentans and isolates

3 討論

Kuttzman&Robnett測定了大約500種酵母的大亞基26S rRNA基因的D1/D2可變區的序列，包括假絲酵母和其他有性型及無性型子囊菌酵母幾乎所有已知種的模式菌株，發現用這段序列（500～600bp）可以將絕大部分種區分開，同一種內不同菌株間D2區的核苷酸差異不超過1%[14]。這些序列均已公布在GenBank=等國際核酸序列數據庫中，給酵母菌的分子鑒定提供了很大方便。本研究擴增了6個分離菌的26S rRNA基因的D1/D2可變區進行測序分析，對分離菌進行分子鑒定。結果發現6株酵母菌與發酵畢赤酵母的同源性最高，相似性為99.7%～100%，按照Kuttzman的同一種內不同菌株間D2區的核苷酸差異不超過1%的結論，所以將6株分離菌鑒定為發酵畢赤酵母菌。本研究為川西北高原地區傳統發酵牦牛酸奶中原始微生物菌種資源的保護及研究提供了菌株。

26SrRNA基因是核糖體RNA基因中的一員，具有進化速率慢，序列保守性高的特點，但同時由于各種原因其基因序列中又具有一定的突變，而這些突變的序列具有種屬的差異，使其作為一種良好的生物分類鑒定材料而受到廣泛的重視，被作為種屬的鑒定以及分子分型的工具[15-17]。本研究中6株分離酵母菌與Genbank中的發酵畢赤酵母菌序列獨立于畢赤酵母屬的其他種酵母形成一個大的分支，發酵畢赤酵母菌大分支中形成3個小的分支，6株分離酵母菌分列其中兩個小的分支中，說明發酵畢赤酵母菌在遺傳進化過程中具有一定多樣性，為發酵畢赤酵母菌的遺傳多樣性研究提供一定參考。

圖4 分離菌與畢赤酵母屬的26S rRNA基因序列系統發生樹Fig.4 Phylogenic tree of 26S rRNA gene sequences of Pichia and isolates

從川西北地區采集的10份傳統發酵牦牛酸奶樣品中的6份中分離到了發酵畢赤酵母，分離率為60%，可見發酵畢赤酵母在該地區牦牛酸奶中是一種廣泛存在的菌株，這與張和平以及Mei Bai等[13]的研究結果基本相符。雖然在很多食品中，Pichia屬的酵母被認為是污染酵母，但是在傳統發酵乳制品中，由于它的某些菌種具有很強的利用乙醇和乳酸的能力，能在過度的酒精和乳酸發酵過程中平衡酒精和乳酸的含量，因此在很多情況下都有Pichia屬酵母菌的檢出，可以認為它是傳統發酵乳制品中正常酵母微生態的一部分。本研究為該地區傳統發酵牦牛酸奶的微生物組成多樣性研究提供參考。

4 結論

本研究從川西北地區的紅原、若爾蓋、康定等地的10份傳統發酵牦牛酸奶樣品中分離鑒定出6株發酵畢赤酵母。為川西北高原地區傳統發酵牦牛酸奶中蘊含的大量原始微生物菌種資源的保護及研究提供菌株，為該地區傳統發酵牦牛酸奶中微生物組成多樣性研究以及發酵畢赤酵母菌的遺傳多樣性研究提供參考。

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Isolation and identification of Pichia fermentans strains from traditional fermented yak yoghurt in the northwest of Sichuan province

WANG Yuan-wei1，ZHANG Cheng-min1，SUO Hua-yi2，YUE Hua1，LI Jian1，TANG Cheng1，*
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China；2.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Based on the conventional morphological and 26S rRNA gene sequencing analysis，the 6 stains of Pichia fermentans were isolated and identified from the 10 samples from traditional fermented yak yogurt in the northwest of Sichuan province.The 6 isolates had 99.7%～100%nucleotide sequence homology with Pichia fermentans which were available from GenBank.Therefore，the results of this study provided information for research of the diversity of microbial compositions of traditional fermented yak yogurt and genetic diversity of Pichia fermentans.

traditional fermented yak yoghurt；Pichia fermentans；isolation and identification

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0184-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.031

2013－09－26 *通訊聯系人

王遠微（1982-），男，碩士研究生，研究方向：分子生物學。

公益性行業（農業）科研專項（201203009）；重慶市基礎與前沿研究計劃項目（cstc2013jcyjA80006）。