加熱處理對魚肉蛋白質理化特性的影響

范三紅，劉曉華，胡雅喃，馮雨薇，馬儷珍（.山西大學生命科學學院，山西太原030006；.天津農學院食品科學系，天津300384）

加熱處理對魚肉蛋白質理化特性的影響

范三紅1，劉曉華1，胡雅喃1，馮雨薇1，馬儷珍2
（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.天津農學院食品科學系，天津300384）

研究鯖魚、鳀魚、沙丁魚魚肉分別在40、50、60、70、80℃加熱30min后肌原纖維蛋白pH、色差、熱變性溫度、蛋白溶解度、羰基和巰基的變化。結果表明：pH隨中心溫度升高基本呈上升的趨勢，不同加熱溫度對pH的差異不顯著（p＞0.05），加熱后的魚肉L*值高于生肉，a*值下降。鯖魚、鳀魚和沙丁魚的肌球蛋白、肌漿蛋白和肌動蛋白的變性溫度分別為42.1、55.2、78.3℃；41.7、51.6、72.9℃；42.8、49.2、75.3℃，其中鯖魚蛋白的熱穩定性較高。蛋白溶解度、巰基隨著加熱溫度的升高而降低，羰基形成量隨著溫度的升高而增加。所以，3種魚肉在80℃時蛋白質完全變性，在達到加熱目的前提下，要保證產品的品質和得率以及降低能源消耗，在生產中加熱終點溫度應控制在80℃以下。

魚肉，肌原纖維蛋白，蛋白質熱變性

鯖魚（mackerel）、鳀魚（anchovy）和沙丁魚（sardine）屬于中上層經濟魚類，其產量在世界魚類總捕撈數量中有舉足輕重的作用。中上層魚類的特點是能形成大的魚群，但由于個體小、易腐敗，不適合鮮食和長時間儲存，產品主要以初加工為主，凍藏的形式出售或用于生產魚粉等低值產品。在魚肉的加工過程中，加熱是一個重要的過程，加熱會引起一系列生物化學反應，賦予產品特別的風味、色澤以及質地[1-3]。這些生物化學反應主要是由于蛋白質在加熱過程中的變性，特別是肌原纖維蛋白的熱變化。肌原纖維蛋白在加熱后形成凝膠，對肉制品的質地和保水性有著重要的作用[4-5]。加熱過程還會造成重量以及營養物質的減少，溫度控制不恰當會直接影響到產品的質量和出品率，影響企業的經濟效益。目前對于3種魚的研究主要集中在營養成分、保鮮、加工工藝方面的報道，但尚未見到有關3種魚加熱過程中的品質變化的報道。本實驗研究3種魚肉經不同加熱溫度處理后，其pH、色差以及蛋白理化特性等的變化。在達到加熱目的前提下，要保證產品的品質以及降低能源消耗，從而為海水小雜魚精深加工利用提供科學的加熱工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯖魚、鳀魚、沙丁魚 福建省泉州市威威貓食品有限公司捕獲，捕獲后迅速冷凍，冰盒裝箱空運到天津農學院食品加工車間，到達實驗室后，每條魚都單獨稱重記錄，并除去魚鱗、內臟，手工采肉后，將魚肉斬拌成魚糜以便取樣的均一性，之后再進行后續實驗，對于不能及時檢測的指標，將剩余魚糜真空包裝后-80℃超低溫冰箱冷凍貯存；KCl、MgCl、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、乙酸乙酯、乙醚、硫酸銅、磷酸氫二鉀、磷酸、焦磷酸鈉 天津市北方天醫化學試劑廠，分析純；三氯乙酸（TCA） 天津光復精細化工研究所，分析純；乙二胺四乙酸（EDTA） 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，分析純；酒石酸鉀鈉 天津光復科技發展有限公司，分析純；無水乙醇 天津市盛淼精細化工有限公司，分析純；考馬斯亮藍G250

上海藍季科技發展有限公司，分析純；2，4-二硝基苯肼（DNPH） 上海申翔化學試劑有限公司，分析純；5.5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸（DTNB） 北京索來寶科技有限公司，分析純；鹽酸胍 Sigma公司，分析純。

FA1104型電子天平 上海精天電子主要儀器有限公司；OZKW-S-6型真空包裝機 上海申越包裝機械制造有限公司；PB-10型酸度計 賽多利斯科學儀器有限公司；FA25型高速剪切乳化分散機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；UV-LS-30型紫外可見分光光度計 龍尼柯上海儀器有限公司；CM-5型色差儀 日本柯尼卡美能達公司；WH2型微型旋渦混合機 上海滬西分析儀器廠有限公司；DSC200F3型差示掃描量熱儀 德國耐馳公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的預處理 精確稱取（40±1）g的魚糜放入直徑為6cm，高為1cm的玻璃模型中，并將表面抹平壓實，裝入蒸煮袋內，用真空封口機封口。實驗每組樣品首先在4℃下測定相關指標。然后將樣品分為5組，每組樣品分別放于40、50、60、70、80℃的恒溫水浴條件下加熱30min，當達到30min后立即取出并迅速冷卻，等待中心溫度降到10℃以下測定相關指標。

1.2.2 pH的測定 精確稱取樣品5g于80mL離心管中，加入蒸餾水45mL，用高剪切乳化分散機乳化（13000r/min）30s，放置10min后用pH計測定。

1.2.3 色差的測定 將魚肉填充于比色皿內，保證測定表面平整，以白板為標準進行樣品色差測定，分別記錄L*、a*和b*值，作為所測樣品的白度值、紅度值和黃度值。

1.2.4 蛋白質熱變性溫度的測定 測定采用差示掃描量熱法，取完全解凍后的魚肉精確稱取5～15mg，密封在鋁盒中并放入樣品池，以空盒做參比，保護氣為氮氣，升溫速率10℃/min，溫度范圍10～100℃。

1.2.5 肌原纖維蛋白的提取 提取依照Xiong[6]的方法作適當修改。稱取5g左右的樣品，加入4倍體積冷卻的蛋白提取液（100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl2、10mmol/L Na2HPO4，pH7.0），用高剪切乳化分散機在13000r/min勻漿30s后，2000r/min、2℃冷凍離心15min，棄上清液，按照上述操作方法重復操作2次，除去水溶性蛋白。取兩次離心所得的沉淀物加入8倍體積冷卻的洗脫液（0.1mol/L NaCl），用高剪切乳化分散機在13000r/min勻漿30s后，2000r/min、2℃冷凍離心15min，棄上清液，重復上述步驟2次，第二次勻漿后用煮沸晾干的兩層紗布過濾，濾液用0.1mol/L HCl調pH至6.2，之后再離心，棄上清液，所得沉淀即為肌原纖維蛋白。為了防止蛋白在操作過程中受熱變性，整個過程需在冰浴中進行。

1.2.6 蛋白濃度的測定 采用雙縮脲法，精確稱取2g左右的蛋白用，水定重到20g左右，并記下質量，混勻，吸取1mL蛋白溶液，加入4mL的酒石酸鉀鈉和3mL的乙醚，旋渦混勻，7500r/min離心10min，然后先用移液槍回收乙醚，再將下層液體吸出，在540nm的條件下測定吸光度值。

1.2.7 肌原纖維蛋白溶解度的測定 參照Benjakul等[7]的方法作適當修改，提取的肌原纖維蛋白用蛋白溶解液（0.6mol/L NaCl，2mmol/L MgCl2，10mmol/L焦磷酸鈉，10mmol/L哌嗪-1，4-二乙磺酸PIPES，pH6.2）配成5mg/mL的溶液，在2℃下每隔10min混勻一次，總共放置4h，之后在2℃、5000r/min條件下離心15min，取其上清液用雙縮脲法測定其蛋白含量。肌原纖維蛋白的溶解程度用溶解性（Ps）來表示，計算公式如下：

1.2.8 總巰基含量的測定 吸取0.5mL濃度為2mg/mL的蛋白溶液（空白吸取0.5mL的蒸餾水）置于10mL的EP管中，加入2.5mL Tris-甘氨酸尿素，再加入20μL DTNB，暗處計時反應25min后在412nm下測定吸光度值（嚴格控制時間）。被溶解的蛋白含量的測定使用考馬斯亮藍法。

1.2.9 羰基含量的測定 羰基含量的測定方法參照Oliver等[8]和Lampila等[9]的方法并稍加修改：量取0.1mL濃度為25mg/mL的蛋白溶液放入1mL離心管中，加入2mL 10mmol/L的DNPH，每隔10min在旋渦振蕩器上振蕩1h，再加入2mL 20%三氯乙酸，在11000r/min下離心3min，倒掉上清液，用濾紙吸干外壁液滴。在通風櫥中加入4mL乙酸乙酯∶乙醇（1∶1），振蕩混勻，除去上清液，洗滌沉淀3次，將得到的沉淀自然風干，風干后加入3mL 6mol/L鹽酸胍溶液，50℃條件下恒溫水浴45min使溶解沉淀，最后在370nm處測吸光值。對照組開始時只加入2mL 2mol/L HCl其余操作相同。分子吸光系數22000mol-1·cm-1，最終計算羰基含量單位為nmol羰基/mg蛋白；蛋白含量使用Lowry法測定在280nm下測定，用牛血清白蛋白做標準曲線測吸光值。

1.3 數據處理

Microsoft Excel 2003計算各個指標的平均值和標準差，Statistix 8.1進行數據分析，顯著性差異（p＜0.05）通過Turkey test程序進行，用Sigmaplot 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 不同加熱溫度對魚肉pH的影響

不同加熱溫度對魚肉pH的影響如圖1所示。隨著溫度的升高，魚肉的pH也隨之上升，鯖魚從加熱前的6.24上升到了6.31，鳀魚從加熱前的6.26上升到了6.45，沙丁魚的pH變化從6.22上升到了6.32，但加熱溫度對pH的影響并不大。pH增加的原因可能是加熱使蛋白質變性，使得肌肉蛋白質在加熱后酸性基團減少。從圖1中還可以看出鳀魚的pH始終要高于鯖魚和沙丁魚，分析原因可能是鯖魚和沙丁魚的脂肪含量較鳀魚要高，脂肪在加熱過程中有一部分水解為脂肪酸，因而pH略低。

圖1 不同加熱溫度對魚肉pH的影響Fig.1 Influence of temperature on pH value of fish

2.2 不同加熱溫度對魚肉色差的影響

不同加熱溫度對魚肉色差的影響如表1所示。由表1可知，3種魚的L*值在隨著溫度的升高而增加，鯖魚和鳀魚在50℃之后差異不顯著（p＞0.05），a*值隨著溫度的升高呈下降的趨勢，b*值則呈現不規則的變化。由感官評定也可發現3種魚肉的顏色變化，加熱之后肉的顏色慢慢變為灰白色。L*值增加可能是肌球蛋白構象遭破壞，亞鐵血紅素氧化被取代所致；a*值下降可能由于亞鐵肌紅蛋白氧化成高鐵肌紅蛋白所致，與肌紅蛋白含量及其溶解度有關。3種魚對比可以看出總體上鯖魚的L*值始終大于鳀魚和沙丁魚，沙丁魚的b*值始終大于鯖魚和鳀魚。

2.3 3種魚蛋白質的熱變性溫度

圖2為DSC測得的3種魚的肌肉的熱變化分析圖。蛋白質在熱變性過程中，吸收熱量從有序變為無序，多肽鏈展開，分子間相互作用破壞。當達到某種蛋白質的變性溫度時，就會在熱分析圖譜中出現一個吸熱峰，根據峰值溫度、峰面積可以確定變性溫度與熱焓等參數[10]。由圖2可以看出，每種魚分別有三個吸熱峰，表示三種蛋白各自的熱變性溫度。吸熱峰的最高點代表該蛋白發生一般變性時的溫度。第一個吸熱峰反映的是肌球蛋白的變性溫度，鯖魚為42.1℃，鳀魚為41.7℃，沙丁魚為42.8℃。第二個吸熱峰反映的是肌漿蛋白的熱變性溫度，鯖魚為55.2℃，鳀魚為51.6℃，沙丁魚為52.2℃。第三個吸熱峰為肌動蛋白的熱變性溫度，鯖魚為78.3℃，鳀魚為72.9℃，沙丁魚為75.3℃。本研究結果與Thorarinsdottir等[11]研究鱈魚肌肉的熱變性溫度（43.5、59.3和73.6℃）、魯長新[12]研究鰱魚肌肉熱變性溫度（41.5、53.28和72.4℃）以及Belibagli等[13]報道的鯖魚肌肉3種蛋白的熱變性溫度（48、56和71℃）基本吻合。由于品種和來源不同，3種魚肌肉的熱變性溫度有所差別。

圖2 3種魚肉蛋白質隨溫度變化的DSC熱流曲線圖Fig.2 DSC thermogram of three fishes muscle protein denaturated as temperature changed

2.4 不同加熱溫度對魚肌肉蛋白溶解度的影響

不同加熱溫度下，3種魚肌原纖維蛋白的溶解度隨溫度變化的影響如圖3所示。蛋白質的溶解性在肉制品加工過程中起著重要的作用，它與肌肉蛋白質的大多數功能相關，是評價肉品品質的一個重要指標。從圖3可以看出，與原料肉相比，熱處理后的魚肉鹽溶性蛋白溶解度顯著降低，說明蛋白質隨溫度的升高發生了不可逆變性，且在加熱初期的下降速度比加熱后期快。總體上鯖魚的蛋白溶解度要高于鳀魚和沙丁魚。

表1 不同加熱溫度對魚肉色差的影響Table 1 Influence of temperature on the color of fish

影響溶解度下降的因素有：a.在加熱過程中，不溶性聚集體在鹽溶性蛋白分子之間形成，使得其溶出量不斷下降；b.蛋白變性后會產生堿溶性蛋白，其在高離子強度下不能溶出但在堿性條件下可以溶出，這使得鹽溶性蛋白含量減少；c.巰基被氧化形成二硫鍵導致肌動球蛋白重鏈聚合，致使鹽溶性蛋白含量下降[14]。

圖3 不同加熱溫度下蛋白溶解度的變化Fig.3 Changes of protein solubility of fish during different heat treatments

2.5 不同加熱溫度對魚肌肉蛋白總巰基的影響

加熱過程中3種魚肉的總巰基含量隨溫度變化曲線見圖4所示。總巰基即包括活性巰基和隱藏的巰基，是水產蛋白中最具反應活性的功能性基團之一。二硫鍵含量下降與肌原纖維蛋白的活性巰基被氧化有關，所以蛋白質在加熱過程中的變性和氧化程度可以通過測定總巰基含量的變化來反映[15]。從圖4可以看出，隨著溫度升高總巰基數下降，下降的原因是因為加熱破壞了肌原纖維蛋白的空間結構，使巰基暴露出來，被氧化成二硫鍵，導致蛋白的完全變性和聚集[16]。另外，蛋白質聚合體的形成也會掩蓋部分巰基，能夠檢測到的游離巰基減少，使得總巰基含量下降。Ko[16]、Yongsawatdingual[17]、孫麗等[14]分別研究的羅非魚、馬鲅魚、金槍魚的肌動球蛋白在加熱過程中總巰基含量明顯下降，同時活性巰基還出現暫時增加然后下降的現象，總巰基氧化為二硫鍵。相比鳀魚和沙丁魚而言，鯖魚的總巰基下降比較緩慢，可能是由于鯖魚的熱穩定性比較高的原因。

圖4 不同加熱溫度下總巰基的變化Fig.4 Changes of total sulthydryl content（nmol/mg）of fish during different heat treatments

2.6 不同加熱溫度對魚肌肉蛋白羰基的影響

加熱過程中3種魚肌肉蛋白羰基含量隨溫度變化曲線見圖5所示。羰基是自由基攻擊氨基酸側鏈與肽鍵產生羰基化合物及其他衍生物，從圖5可以看出，隨著溫度升高，羰基含量呈上升的趨勢。4℃時3種魚的羰基含量比新鮮魚肉的羰基值要大許多，原因是魚在運輸以及貯藏過程中冰晶的多次重新形成，破壞了細胞結構以及肌纖維完整性，加速了蛋白氧化。魚肉中一些天然的抗氧化劑在貯藏和加熱過程中被逐步分解，也是導致羰基含量變化較大的原因。

圖5 不同加熱溫度下羰基的變化Fig.5 Changes of carbonyl content（nmol/mg）of fish during different heat treatments

3 結論

鯖魚、鳀魚和沙丁魚的肌球蛋白、肌漿蛋白和肌動蛋白的變性溫度分別為：42.1℃-55.2℃-78.3℃；41.7℃-51.6℃-72.9℃；42.8℃-49.2℃-75.3℃，要使得蛋白質全部變性，鯖魚、鳀魚和沙丁魚的加熱溫度需分別達到78.3℃、72.9℃、75.3℃，其中鯖魚蛋白的熱穩定性較高，到78.3℃時才能夠完全變性，因此為了節省資源，3種魚的加熱溫度應該控制在78.3℃、72.9℃、75.3℃以下。出現這種差異主要是來源、品種以及冷凍方式不同對魚肉蛋白質的熱穩定性產生的影響。蛋白溶解度、巰基隨著加熱溫度的升高而降低，羰基形成量隨著溫度的升高而增加。加熱使得蛋白質結構發生不可逆的變化，隨著溫度上升，變性速度加快。pH隨加熱溫度升高呈上升的趨勢，加熱后的魚肉L*值高于生肉，a*值下降，但不同加熱溫度對pH的差異不顯著（p＞0.05），但鳀魚的pH始終要高于鯖魚和沙丁魚，原因可能是鯖魚和沙丁魚的脂肪含量較鳀魚要高，脂肪在加熱過程中有一部分水解為脂肪酸。此結果為海水魚的深加工提供理論依據。

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Effect of heat treatment on protein in physical and chemical properties

FAN San-hong1，LIU Xiao-hua1，HU Ya-nan1，FENG Yu-wei1，MA Li-zhen2
（1.College of Life Science，Shanxi University，Shanxi，Taiyuan 030006，China；2.Department of Food Science，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

The myofibrillar’s physical and chemical characteristics of mackerel，anchovy and sardine had been studied at 40，50，60，70 and 80℃ for 30min，respectively.The results showed that pH increased with the temperature increasing，but no obvious changes were observed at higher temperature.The brightness L* increased in comparison with raw meat，but the change of redness a*decreased after heating.Myosin，sarcoplasmic protein and action protein thermal denaturation temperature of mackerel，anchovy and sardine muscle were 42.1，55.2，78.3℃，41.7，51.6，72.9℃，42.8，49.2，75.3℃，respectively.Mackerel protein had higher thermal stability.Protein solubility and the total sulfhydryl distinctly decreased with the temperature increased，the amount of carbonyl formation increased as the temperature increased.In conclusion，the protein of three fishes denatured at 80℃ completely.The end point temperature should be controlled at 80℃ in order to achieve the purpose of thermal processing，ensuring product quality and yield，and avoiding unnecessary energy consumption.

fish；myofibrillar；thermal property

TS254.1

A

1002-0306（2014）12-0104-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.013

2013－10－09

范三紅（1963-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：食品科學。

山西省自然科學基金項目（2012011031-4）；山西省高等學校高新技術產業化項目（20111003）。