桂枝提取物抑菌活性研究

周夢嬌，萬春鵬，陳金印（江西農業大學農學院，江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，江西南昌330045）

桂枝提取物抑菌活性研究

周夢嬌，萬春鵬，陳金印*
（江西農業大學農學院，江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，江西南昌330045）

以柑橘青、綠霉菌及獼猴桃灰霉菌等17種植物病原菌為指示菌，分別采用杯碟法、菌絲生長速率法對桂枝提取物的抑菌活性進行研究，結果表明桂枝提取物具有較廣泛的抑菌譜，對這17種供試病原菌均表現出一定的抑制效果，其中對柑橘青、綠霉的抑菌圈大小分別為（32.67±0.23）mm和（30.50±0.17）mm，最小抑菌濃度（MIC）分別為3.125mg/mL和6.25mg/mL，最小殺菌濃度（MFC）分別為6.25mg/mL和12.5mg/mL，而在其他15種植物病原菌中，桂枝提取物對車前草穗枯菌的活性最強，半抑制濃度（EC50）為0.4386mg/mL，對其他病原菌的EC50為1～22mg/mL。

桂枝，植物病原菌，抑菌活性

植物病害是農業生產活動和采后貯藏最主要的瓶頸之一，據聯合國糧農組織（FAO）統計，每年因植物遭受病害造成的減產平均損失為總產量的10%～15%[1-2]。目前植物病害防治主要依靠化學殺菌劑，但其殘留量大，對人和環境都有很大的危害，且使用的持續性及普遍性導致很多植物病原菌產生抗藥性[2]，隨著人類“回歸自然”的呼聲越來越高，國際社會把目光轉向了高效、低成本、低毒、低殘留、不易產生抗性的天然植物提取物，如艾蒿、連翹、丁香、苦參等植物提取物因其具有較強的抗氧化性及抑菌效果，被廣泛應用于食品防腐劑、抗氧化劑、果蔬貯藏保鮮劑、生物農藥等方向[3]。我國中草藥資源豐富，大部分中草藥在中藥領域具有廣泛研究應用，但只有少部分于植物病害防治方面得到了探究，因而亟需擴大中草藥提取物及植物病原菌的篩選范圍。

桂枝（Ramulus cinnamomi）是樟科（Cinnamonum）常綠喬木植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl.）的干燥嫩枝，主要分布在廣西、廣東、云南、福建和海南等地，其性味辛、甘、溫，有發汗解肌、溫經通脈之功效，中醫多用于治療風寒感冒、脘腹冷痛和關節痹痛等癥[4]，是一種運用極其普遍的中藥，具有較好的抑菌[5]、抗病毒[6]、抗氧化[7]和抗過敏[8]等藥理作用。目前對桂枝的研究多局限于醫藥方面，而將其運用于植物病害防治方面未見報道。本實驗通過研究桂枝提取物對17種常見植物病原菌的抑菌活性，為充分開發利用桂枝資源及植物病害田間防治實驗提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

的測定 二倍稀釋法稀釋桂枝提取液，并制得提取液終濃度為0.195～100mg/mL含藥培養基，平板涂布法將供試菌液均勻涂于培養基上，設置空白對照組（培養基不接種菌）、菌液對照組（培養基接種菌），將其置于28℃的培養箱中培養2d，以無菌生長的培養皿的含藥濃度為其MIC，將無菌生長的培養皿繼續培養7d后觀察，以無菌生長的培養皿的含藥濃度為其MFC[11]，每個處理重復3次。

1.2.2.4 桂枝提取物對其他15種植物病原菌抑菌活性的室內毒力測定 參考方法[12]，無菌條件下，將不同體積的桂枝提取液加入到融化的PDA中，制成終濃度分別為25、5、1、0.2mg/mL的含藥培養基，以純PDA培養基為對照，用直徑6mm打孔器打取活化好的各供試菌菌落的邊緣菌塊，分別將其轉接到各不同濃度的含藥PDA培養基及對照培養基中，每個處理重復3次，并將其置于28℃恒溫培養箱中培養，7d后記錄各菌落生長情況，并用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率：抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 桂枝提取物對柑橘青、綠霉菌的抑制活性

由表1可知，桂枝提取物對柑橘青、綠霉菌的菌絲生長表現出不同的抑制作用，對柑橘青、綠霉菌的抑菌圈大小（32.67±0.23）mm、（30.50±0.17）mm，此外，桂枝提取物在較低濃度對供試菌即表現出較好的抑制作用，對柑橘青、綠霉菌的MIC分別為3.125mg/mL和6.25mg/mL，MFC分別為6.25mg/mL和12.5mg/mL，因而柑橘青霉菌對桂枝提取物敏感性較優于綠霉菌。

2.2 桂枝提取物對其他15種植物病原菌的室內毒力測定

表1 桂枝提取物對柑橘青、綠霉菌的抑制效果Table 1 Antifungal activity of Ramulus cinnamomi extracts on P.italicum and P.digtium

以桂枝提取液的濃度對數值為橫坐標，平均抑制率的機率值為縱坐標，用DPS軟件繪制標準曲線，求得桂枝提取液對15種供試植物病原菌的毒力回歸方程，相關系數，EC50及其置信區間如表2所示。由表2可知，桂枝提取液對15種供試菌均有一定的抑菌活性，EC50能有效反映殺菌劑對病原菌抑制活性大小，EC50數值越小，說明殺菌劑對病原菌抑制活性越強。本實驗中桂枝提取液對15種供試菌EC50值由小到大依次為：車前草穗枯病菌，獼猴挑擬莖點霉菌、玉黍蜀赤霉菌、棗擬莖點霉菌、水稻紋枯菌、西瓜枯萎菌、辣椒疫霉菌、茄褐紋菌、柑橘酸腐菌、萵苣菌核核盤菌、柑橘炭疽菌、獼猴桃灰霉菌、葡萄座腔菌、柑橘黑

1.1 材料與儀器

桂枝（Ramulus cinnamomi） 2013年3月5日購于江西省樟樹市華豐藥業公司；95%乙醇 分析純；PDA培養基 自制；柑橘青霉菌（Penicillium italicum）、柑橘綠霉菌（Penicillium digitatum）、柑橘炭疽菌（Colletotrichum glecosporioides）、柑 橘 酸 腐 菌（Geotrichum candidum）、柑橘黑斑菌（Phoma citricarpa）、獼猴桃灰霉菌（Botrytis cinerea）、獼猴桃擬莖點霉菌（Phomopsis asparagi）、棗擬莖點霉菌（Phomopsis mauritiana）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria parva）、萵苣菌核核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、茄褐紋菌（Phomopsis vexans）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、芝麻鐮孢莖枯菌（Fusarium oxysporum）、水稻紋枯菌（Rhizoctonia solani）、玉黍蜀赤霉（Gibberella zeae）、西瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）和車前草穗枯菌（Diaporthe angelicae） 均由江西農業大學植物病理實驗室提供。

5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；R-3旋轉蒸發儀 瑞士BUCHI公司；KQ-500B超聲波清洗機 昆山超聲儀器有限公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司；MIR-254恒溫培養箱 日本三洋公司；LX-300冷卻水循環機 北京長流科學儀器公司；HS-1300U超凈工作臺 蘇靜集團蘇州安泰公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桂枝提取物的制備 參考課題組前期提取方法[9]，將桂枝于60℃真空干燥箱烘干后粉碎，過40目篩，取篩下粉末用95%乙醇溶劑超聲波輔助浸提2h，提取液減壓濃縮后離心，乙醇定容得到1g藥材/mL桂枝提取液。

1.2.2 抑菌活性的測定

1.2.2.1 菌種活化及菌懸液的配制 無菌條件下，將柑橘青、綠霉菌接種到斜面PDA培養基上，于28℃恒溫培養箱中活化一周，用無菌水將其分別洗入三角瓶中，過濾，將濾液充分搖勻制成孢子懸浮液，用血球計數板計數，使各菌液孢子濃度均為108cfu/mL。其余15種病原菌用直徑6mm打孔器打取各供試菌菌落的邊緣菌塊，并轉接到PDA培養基中，于28℃恒溫培養箱中活化一周，備用。

1.2.2.2 桂枝提取物對柑橘青、綠霉菌抑菌活性的測定 無菌條件下，吸取1mL供試菌液于99mL融化的PDA培養基中，使菌液終濃度為106cfu/mL[10]，搖勻后倒平板，采用杯碟法[9]，對桂枝提取物進行抑菌活性測定，重復3次，將各平板置于28℃的恒溫培養箱中培養，48h后采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.2.3 桂枝提取物對柑橘青、綠霉菌的MIC和MFC斑菌和芝麻鐮孢莖枯菌。桂枝提取液對車前草穗枯病菌的抑菌效果最好，EC50為0.4386mg/mL，其毒力回歸方程為y=6.5999+4.0511x，斜率較大為4.0511，說明該病原菌對桂枝提取液較敏感。對獼猴挑擬莖點霉菌、玉黍蜀赤霉菌等12種供試菌的抑制效果次之，EC50分別在1～10mg/mL之間，對柑橘黑斑菌及芝麻鐮孢莖枯菌的抑制效果最差，EC50分別為13.9462mg/mL及21.1945mg/mL。

表2 桂枝提取液對15種植物病原菌的抑菌效果Table 2 Antifungal activity of Ramulus cinnamomi against 15 phytopathogens

3 結論

桂枝對柑橘青、綠霉菌、獼猴桃灰霉菌等17種常見植物病原菌均表現出一定的抑制作用，因而桂枝提取物中含有抑制多種植物病原菌生長的活性成分，有較為廣泛的抑菌譜，為充分開發利用桂枝這一植物資源，需進一步完善其抑菌活性物質提取、分離、純化方法，并進行安全毒理學評價，再結合構效關系、化學仿生合成以滿足產業化需求。

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Study on antifungal activity of Ramulus cinnamomi

ZHOU Meng-jiao，WAN Chun-peng，CHEN Jin-yin*
（Jiangxi Key Laboratory for Postharvest Technology and Non-destructive Testing of Fruits&Vegetables，College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

Seventeen kinds of phytopathogens such as Penicillium italicum，Penicillium digitatum and Botrytis cinerea were used as indicators to explore the antifungal activities of Ramulus cinnamomi by cylind-plate and mycelial growth rates methods，respectively.The results showed that Ramulus cinnamomi had a broader spectrum antifungal activity against the 17 sorts of tested phytopathogens，the inhibition zones against P.italicum and P.digitatum were（32.67±0.23）mm and（30.50±0.17）mm，respectively.While the minimum inhibitory concentrations（MIC）gainst P.italicum and P.digitatum were 3.125mg/mL and 6.25mg/mL，respectively，and the minimum fungicidal（MFC）concentrations were 6.25mg/mL and 12.5mg/mL，respectively.Meanwhile，the toxicity of indoor test of Ramulus cinnamomi against the other 15 phytopathogens showed that Ramulus cinnamomi extracts had the best antifungal activity on Diaporthe angelicae with the EC50value of 0.4386mg/mL. The antifungal activities against other tested pathogens with EC50values ranged from 1 to 22mg/mL.

Ramulus cinnamomi；phytopathogens；antifungal activity

TS201.2

A

1002-0306（2014）12-0096-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.011

2013－09－16 *通訊聯系人

周夢嬌（1990-），女，碩士研究生，研究方向：柑橘采后貯藏技術。

“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD38B03-2）；國家自然科學基金項目（31160343）；江西省教育廳科技落地計劃項目（111）；江西省“贛博英才555工程（2012）；農業科技成果轉化資金項目（2011GB2C500017）；江西省博士后科研擇優資助項目（2013KY31）；留學人員科技活動項目（人社廳函[2013]277號）；中國博士后科學基金第54批面上項目（2013M541870）。