三種食源性致病菌多重PCR檢測方法的建立

舒 暢，姜琛璐，鐘慈平，李 林（西南大學食品科學學院，重慶400715）

三種食源性致病菌多重PCR檢測方法的建立

舒 暢，姜琛璐，鐘慈平，李 林*
（西南大學食品科學學院，重慶400715）

目的：建立同時快速檢測沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7的多重PCR方法。方法：根據沙門氏菌的invA基因、志賀氏菌的ipaH基因及腸出血性大腸桿菌O157∶H7的uidA基因設計3對引物，通過單因素實驗、L9（34）正交實驗優化反應體系，并對多重PCR擴增的敏感性進行分析。結果：3對引物能特異性擴增出495、620、252bp的目的片段；在最優多重PCR反應體系下，多重PCR檢測3種致病菌的靈敏度達104CFU/mL；將該法應用于人工污染實驗，可在5h內得到準確、穩定的檢測結果。結論：該方法操作簡單、檢測特異性和靈敏度較高，能夠實現對沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7 3種食源性致病菌的快速監控和診斷。

食源性致病菌，多重PCR，沙門氏菌，志賀氏菌，腸出血性大腸桿菌O157∶H7

食品安全是當前世界公共衛生問題的焦點，近年來，食品安全事件頻繁發生，其中食源性疾病以其高發病率成為食品安全面臨的最突出問題。據世界衛生組織（WHO）統計，全球每年的食源性疾病病例多達數十億例，其中有220萬人因此而喪生[1]。引起食源性疾病的首要危害因子是食源性致病菌，其來源多樣、繁殖迅速[2]，常見的有沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、單增李斯特菌（Listeria Monocytogens）等[3]。目前，對食源性致病菌的檢測多采用常規培養法、免疫法等[4]，程序繁瑣，耗時費力，難以滿足公共衛生事件應急處理快速、準確的需要。隨著分子生物學的發展，尤其是PCR技術的誕生，針對如沙門氏菌[5]、金黃色葡萄球菌[6]、志賀氏菌[7]、單增李斯特菌[8]等某一種菌或某一類致病菌的PCR方法得以建立，彌補了傳統培養方法的不足，提高了檢測效率及準確性。然而，在食品工業高速發展的今天，食品的污染情況更為復雜，污染致病菌的不確定性及多樣性使檢測工作的難度加大，容易誤檢或漏檢[9-10]，因此，建立一種高效、靈敏、特異性強的檢測方法迫在眉睫。多重PCR技術為此提供了可能，它可實現在一個反應體系中，使用多對特異性引物，完成對多種病原微生物的同時檢測或鑒定[11]，具有快速、經濟、簡便的特點，是未來食源性致病菌檢測技術的主要發展趨勢[12]。

沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌是三種常見的食源性致病菌，均屬腸桿菌科，其形態和生理特性較相似，容易交叉污染，引起食物中毒[13]。采用多重PCR技術同時對該三種菌進行檢測具有較大的實用價值，然而，國內外在這方面的研究成果較少。本研究通過引物設計、單因素、正交實驗確定了方法，并通過特異性和靈敏度實驗對該方法進行了效果驗證，并分析了實驗中出現的問題及解決方案，以期為快速檢測食源性致病菌、有效控制病原菌傳播、預防食物中毒、減少疾病發生提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株編號、名稱及來源 見表1；細菌基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；10×PCR Buffer（Mg2+free）、MgCl2（25mmol/L）、dNTP Mixture（2.5mmol/L each）、rTaq DNA polymerase（5U/μL）、6×DNA loading Buffer、100bp DNA ladder、DL1000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；沙門氏菌、志賀菌屬瓊脂平板（ss瓊脂）、麥康凱瓊脂平板 重慶龐統醫療器械有限公司；O157顯色培養基 鄭州博賽技術股份有限公司；腦心浸液肉湯 英國OXOID公司。

PTC-200核酸擴增儀 美國MJ公司；DYY-11電泳儀 北京市六一儀器廠；ChemiDoc XRS凝膠成像儀 美國伯樂公司；eppendorf離心機 德國eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據三種食源性致病菌的特異性保守序列[14-16]，即沙門氏菌的invA基因、志賀氏菌的ipaH基因和腸出血性大腸桿菌的uidA基因，利用軟件Oligo6.0、Primer5.0[17]設計引物，引物序列見表2，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 菌株及其來源Table 1 Strains in this study

表2 多重PCR引物序列Table 2 Primers for multiplex PCR

1.2.2 細菌培養及模板DNA的制備 將沙門氏菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7分別接種于腦心浸液肉湯中，36℃過夜培養，采用細菌基因組DNA提取試劑盒制備模板DNA，產物于-20℃保存備用。

1.2.3 單重PCR反應

1.2.3.1 單重PCR體系的建立及引物特異性驗證 分別以3株沙門氏菌、2株志賀氏菌、2株腸出血性大腸桿菌O157∶H7的基因組DNA為模板，采用25μL反應體系：上下游引物（10mmol/L）各0.5μL，10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L each）2μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，滅菌超純水16.25μL，模板1μL；反應程序：94℃預變性4min，94℃45s、60℃90s、72℃1min，30個循環，72℃延伸7min，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后通過紫外成像進行檢測；同時以上述程序擴增蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、致瀉大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌等菌株的基因組DNA，驗證所設計引物的特異性。

1.2.3.2 單重PCR靈敏度檢測 分別挑取3種細菌（以鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、福氏志賀氏菌CMCC51572和腸出血性大腸桿菌O157∶H7 ATCC43888為例）于滅菌生理鹽水中制成菌懸液，用比濁儀測試其濃度至108CFU/mL，然后用滅菌生理鹽水按10倍梯度稀釋，使菌液濃度為108～100CFU/mL，分別提取DNA后，按上述條件進行PCR擴增，分析單重PCR擴增的敏感性。

1.2.4 多重PCR反應

1.2.4.1 多重PCR反應的建立及產物鑒定 將沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7的基因組DNA進行組合作為模板，采用1.2.3.1的PCR反應條件進行擴增，并用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶，送往生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4.2 多重PCR反應體系優化 實驗流程如下所示：

a.單因素實驗：對引物、Mg2+、dNTP、Taq酶4個因素設計7個水平進行實驗，確定各因素的適宜水平范圍：引物添加量：上下游引物（10μmol/L）依次各加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7μL；Mg2+（25mmol/L）添加量：依次加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL；dNTP（2.5mmol/L）添加量：依次加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL；Taq酶添加量：依次加入0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40μL。引物、Mg2+、dNTP、Taq酶4個因素的固定水平取7個水平的中間值，分別為0.4、2.0、2.0、0.25μL。

b.正交實驗：單因素實驗確定的最佳水平并不能代表整個反應體系的最佳組合，不同的組合方式也可能對反應體系產生影響。本研究選取單因素實驗確定的各因素的3個最佳水平，選用L9（34）正交設計表（見表3）進行實驗。

表3 L9（34）實驗方案Table 3 The project of L9（34）experiment

1.2.4.3 退火溫度優化 在實驗確定的最佳反應體系基礎上，對PCR退火溫度進行優化篩選，依次設為55、56、57、58、59、60、61、62、63、64℃，從中確定最佳退火溫度。

1.2.4.4 多重PCR靈敏度 取三種菌108～100CFU/mL各相同濃度的菌液等量混合，制成濃度為108～ 100CFU/mL的混合菌懸液，分別提取各稀釋度的基因組DNA，按最優PCR反應體系進行擴增。

1.2.5 人工染菌 取經國標驗證不含本研究的三種食源性致病菌的奶粉25g，加入225mL滅菌生理鹽水均質，分別取三種菌過夜培養后的等濃度菌液各1mL加入7mL奶粉勻漿中混勻，然后以均質液作為稀釋液進行10倍稀釋，制成108～100CFU/mL的菌懸液，分別提取基因組DNA，按最優多重PCR體系進行擴增。

2 結果與分析

2.1 單重PCR反應

2.1.1 單重PCR擴增及引物特異性驗證 3株沙門氏菌（鼠傷寒沙門氏菌14028、都柏林沙門氏菌50761、布倫登盧普沙門氏菌H9812）、2株志賀氏菌（福氏志賀氏菌51572、宋內志賀氏菌51592）和2株腸出血性大腸桿菌O157∶H7（腸出血性大腸桿菌O157∶H7 43888、腸出血性大腸桿菌O157∶H7 43889）的PCR擴增結果呈陽性，分別得到長度為495、620、252bp的目的片段，片段符合預期產物大小。其余9株菌株呈陰性，且無非特異性條帶，表明本研究設計的3對引物特異性較好。

圖1 單重PCR擴增結果及引物特異性驗證Fig.1 The result of single PCR amplification and specificity of the primers

2.1.2 單重PCR擴增敏感性分析 由圖2可知，單重PCR檢測沙門氏菌的靈敏度達104CFU/mL，志賀氏菌的靈敏度達103CFU/mL，腸出血性大腸桿菌O157∶H7的靈敏度達104CFU/mL。

2.2 多重PCR反應

2.2.1 多重PCR反應的建立及產物鑒定結果 將三種食源性致病菌的基因組DNA組合后進行PCR擴增，均能得到目的片段，且相應的目的條帶清晰，未發生交叉影響，表明本研設計三對引物可用于進行多重PCR擴增；將目的條帶回收后測序，測序結果表明，沙門氏菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7的擴增序列與Genbank中公布的基因序列的同源性均達98%以上，從而證實PCR產物確為目的產物。

圖2 單重PCR檢測三種致病菌的靈敏度Fig.2 Detection sensitivity of single PCR for three pathogens

圖3 多重PCR反應的建立Fig.3 Establishment of multiplex PCR

2.2.2 多重PCR擴增條件優化結果

2.2.2.1 單因素實驗結果 根據單因素實驗結果（圖3），引物、Mg2+、dNTP、Taq酶4個因素的3個適宜水平確定如下：引物（10mmol/L）適宜添加量：上下游引物各添加0.5、0.6、0.7μL；Mg2+（25mmol/L）適宜添加量：1.5、2.0、2.5μL；dNTP（2.5mmol/L each）適宜添加量：依次加入0.5、1.0、1.5μL；Taq酶適宜添加量：依次加入0.15、0.20、0.25μL。

圖4 單因素實驗結果Fig.4 The results of single-Factor experiment

2.2.2.2 正交實驗結果 根據單因素實驗確定的4因素3水平設計正交實驗，由圖5可見，在9組反應體系中，由于引物、Mg2+、dNTP、酶4個因素添加量組合的不同，擴增效果出現了顯著差異，其中第8泳道效果最佳，因此，25μL多重PCR最佳反應體系確定為：上下游引物各0.7μL（10μmol/L），10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L each）0.5μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，滅菌超純水12.55μL，模板各1μL。

圖5 正交實驗優化多重PCR反應體系結果Fig.5 Optimization of multiplex PCR by orthogonal experiment design

2.2.3 最佳退火溫度 如圖6所示，選擇55～64℃進行溫度梯度PCR，均能得到目的條帶，其中第3泳道的條帶最亮，因此選擇57℃作為本研究的最佳退火溫度。

圖6 最佳退火溫度的選擇Fig.6 Optimization of annealing temperature

2.2.4 多重PCR靈敏度檢測 由圖7可見，多重PCR同時檢測沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7的靈敏度為104CFU/mL。一般而言，多重PCR的檢測靈敏度低于單重PCR的靈敏度，因為在多重PCR反應體系中，模板與引物的結合幾率可能隨引物、模板的種類和添加量的增加而降低[18]，但本研究通過單因素實驗和正交實驗，優化出反應體系中各因素的最佳配比，有效地提高了模板與引物的結合效率，從而建立了與單重PCR靈敏度相當的多重PCR反應。

圖7 多重PCR同時檢測沙門氏菌、志賀氏菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7的靈敏度

2.3 人工染菌

圖8 牛乳樣品人工染菌的檢測靈敏度Fig.8 Detection sensitivity of artificial pollution

由圖8可見，采用本研究建立的多重PCR方法檢測人工污染奶粉中的三種致病菌，可得到清晰、分明的條帶，檢出限為106CFU/mL，比沒有食品介質的多重PCR靈敏度低2個數量級，這是因為食品中的成分十分復雜，有些成為PCR抑制因素，可能降低PCR檢測的靈敏度，有研究表明脂肪是導致PCR檢測靈敏度下降的因素之一[19]。

3 結論與討論

多重PCR是以單重PCR為基礎發展而來的檢測技術，該技術不僅可實現對多種致病菌同時進行鑒定，還可對同一致病菌不同耐藥性[20-22]或血清型[23]進行檢測。到目前為止，多重PCR因其高效、快速、低成本等優點而被廣泛用于食源性致病菌的檢測中。然而，多重PCR并不是簡單的混合體系反應，檢測過程中會受多種因素的影響，首先，多重PCR的引物設計是關鍵，Settanni L[24]通過實驗表明為了確保一對引物只能特異性擴增出唯一的產物，引物設計應更長、解鏈溫度（Tm）應更高。本研究選取編碼沙門氏菌侵襲蛋白的invA基因、編碼志賀氏菌侵襲性質粒抗原的ipaH基因及編碼大腸桿菌β-葡萄糖醛酸酶的uidA基因作為目的基因，結果顯示引物特異性較好；其次，引物、dNTP、Mg2+、Taq酶、退火溫度等是影響PCR的重要因素，多重PCR體系因存在多對引物、多個模板而更加復雜，鑒于此，本研究結合單因素實驗和L9（34）正交實驗建立了多重PCR的最佳反應體系（25μL）：上下游引物各0.7μL（10μmol/L），10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L each）0.5μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，滅菌超純水12.55μL，三種細菌的模板DNA各1μL，經驗證該反應的特異性較好。但相比于其他PCR反應，本研究中的單重PCR及多重PCR的靈敏度相對較低，主要影響因素可能是模板，本研究采用試劑盒法提取基因組DNA，得到的模板純度高，但量少，且因客觀條件限制，不能對模板濃度進行測定，無法摸索最適反應濃度，可能對反應靈敏度造成了影響。后續研究中可在模板提取的最后一步適當少加入TE溶液溶解，以提高DNA模板的濃度；也可采用多種基因組提取方法，并進行效果對比；另外，在確定模板濃度的基礎上，可將其加入到單因素實驗、正交實驗中，尋找反應各因素的最佳配比。此外，本研究所確立的多重PCR體系可直接從人工污染的奶粉中檢測出沙門氏菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7 3種致病菌，從樣品處理到檢測結束僅需5h左右，但靈敏度降低了兩個數量級，主要是由于樣品中存在諸多干擾成分，如脂肪、多糖、蛋白質等均會影響多重PCR的檢測靈敏度，可通過對樣品進行增菌培養后再進行多重PCR來解決這一問題[25-26]。在后續的研究中，我們也將進一步探索提高檢測靈敏度的途徑，以期建立更加高效、穩定、靈敏的多重PCR方法。

本研究建立的多重PCR體系可同時檢測沙門氏菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7，具有操作簡單、快速、準確等優點，為食源性致病菌的快速篩查提供了重要的技術支持。

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Establishment of a multiplex PCR detection method for three foodborne pathogens

SHU Chang，JIANG Chen-lu，ZHONG Ci-ping，LI Lin*
（College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Objective：To establish a rapid multiplex polymerase chain reaction（PCR）method for the simultaneous detection of Salmonella spp.，Shigella spp.and Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7.Methods：Three pairs of primers had been designed based on the invA gene in Salmonella spp.，ipaH gene in Shigella spp. and uidA gene in Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7，single-factor experiment and L9（34）orthogonal experiment were used to optimize multiplex PCR amplification system，and the sensitivity of multiplex PCR was also analyzed.Results：Fragments of 495，620，252bp were obtained respectively.Under the optimized condition，the detection sensitivity of multiplex PCR for three pathogens was 104CFU/mL.This method had been applied to artificial experiment，the result was accurate and steady，which could be obtained within 5h. Conclusion：A simple，specific and sensitive multiplex PCR method had been established and it was valuable for rapid monitoring and diagnosis for Salmonella spp.，Shigella spp.and Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7.

foodborne pathogens；multiplex polymerase chain reaction（PCR）；Salmonella spp.；Shigella spp.；Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0049-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.001

2013－10－09 *通訊聯系人

舒暢（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質量控制。