蜜蜂消化道內含物細菌群落組成的PCR-DGGE分析

崔海輝

（浙江育英職業技術學院,浙江杭州 310018）

蜜蜂消化道內含物細菌群落組成的PCR-DGGE分析

崔海輝

（浙江育英職業技術學院,浙江杭州 310018）

通過PCR-DGGE技術研究蜜蜂消化道內含物的細菌群落組成,結合蜜蜂消化道細菌的形態特征,對蜜蜂腸道可培養的細菌進行分類與鑒定,研究分析了春季和夏季2個季節健康的蜜蜂工蜂的腸道菌相區別,同時還比對了春季健康蜜蜂和病蜂腸道菌相的區別。

蜜蜂；消化道；PCR-DGGE；分析

蜜蜂屬于昆蟲綱膜翅目細腰亞目針尾部蜜蜂總科蜜蜂科（A pi da e）蜜蜂亞科（A pi na e）蜜蜂屬（A p i s）,是以雌性個體為主的社會性群體生活昆蟲,分布于除南北極以外的世界各地［1］。

蜜蜂體內存在的微生物菌相與蜜蜂的營養生理活動有著密切的聯系,兩者相互依存、互相作用而不可分割,微生物對寄主腸道的消化、吸收、營養、免疫、生物拮抗等很多方面起著重要作用［2-4］。因此微生物的分布及種類直接影響到蜜蜂的健康。中國作為養蜂大國,但國內對健康蜜蜂及病蜂腸道的菌相分析極為少見。因此,開展蜜蜂微生物生態的研究對蜜蜂的養殖、保健和蜂產業的深度開發都有重要意義。

由于自然界中85%～99%的細菌是不可分離培養的［5］,因此通過分離純化培養來鑒定腸道微生物種類,難以真實反映蜜蜂消化道細菌群落組成的實際情況。而隨著分子生物學技術的發展,直接抽提樣品中總DNA,通過擴增16S r R N A片段和D G G E指紋圖譜分離［5-6］,可以更加全面地分析微生物群落組成,目前已成為國內外微生物分子生態學研究的常用方法。

本文采用16S r R N A基因克隆文庫法,分析冬季和春季健康的蜜蜂工蜂的腸道菌相區別,同時還比對了春季健康蜜蜂和病蜂腸道菌相的區別,為開展蜜蜂腸道微生態研究提供基礎性參考資料,也為今后蜜蜂疾病的生物防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

健康活體的蜜蜂工蜂成蟲和患爬蜂病的蜜蜂采自浙江蕭山市各大養蜂的農場。樣品采集時間為春季和冬季,春季時同時采集患有爬蜂病的病體。每次采樣時,每個蜂場的取樣量為200只左右蜜蜂,采樣及運送過程中盡量保持其活力,送至實驗室后,立刻取組織進行增菌培養。

1.2 樣品總DNA提取

采用B i o s pi n細菌基因組DNA提取試劑盒提取樣品中的微生物基因組DNA,提取方法按試劑盒說明書執行,具體操作步驟如下。

收集細菌,取0.5～4.0 m L細菌于最大速度離心1 min,吸棄上清。加入100μLE LBuffer,使用tip頭吹打均勻。37℃溫育40 min,對部分革蘭氏陽性細菌,可將溫育時間延長至1 h。加入100μL R S B uf f e r,隨后加入PK Solution,充分混勻。于56℃環境中溫育15 min,對于難裂解樣品可將溫育時間延長至30 min。加200μLG AB uf f e r混合均勻,12 000g離心5～10 min。將上清液移至新的1.5 m L離心管,加入400μLB A Buffer,混合均勻。將混合液體轉移至Spincolumn,10 000g離心1 min,棄去接液管中液體。向Spin column中加入500μLGB indingB uffer,10000g離心30s,棄接液管中液體。向Spincolumn中加入500μLWash Buffer,10 000g離心30 s,棄接液管中液體。重復該操作1次。再次將Spincolumn于10 000g離

心1 min,并將Spincolumn轉移至新的1.5 m L離心管。向Spincolumn中加入50μLE l ut i o n B uf f e r,室溫溫育1 min,于12 000g離心1 min,棄去Spincolumn,1.5 m L離心管中液體含有DNA。細菌16S r DNAV 3區P C R擴增。

1.3 P C R反應條件

94℃預變性5 min；94℃變性1 min,58℃退火1 min,72℃延伸2 min,35個循環,72℃延伸10 min,15℃保溫［7-9］。按照表1所列,在P C R管內加入各種試劑后在P C R儀上進行反應。

表1 P C R擴增體系參數

1.4 DGGE凝膠電泳

1.4.1 丙烯酰胺變性膠配置

采用35%和55%變性膠溶液進行D G G E電泳,具體配置方法如表2,蒸餾水均加至100 m L。

表2 不同濃度變性膠溶液配置

1.4.2 變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳制膠板的裝配參考儀器說明書進行。制膠和上樣的具體步驟如下。

取35%和55%變性膠溶液各15 m L,置于2個離心管中,每管加入15μLT E ME D,100μL 10%A P S,迅速混勻,用連有聚乙烯管分別吸取高濃度和低濃度膠溶液。

分別將含有高濃度、低濃度膠溶液的注射器放在梯度傳送系統的正確位置并固定好,再將注射器的聚丙烯管用三通管相連。

輕柔并勻速地旋轉凸輪來傳送溶液,帶膠灌滿后,小心插入梳子,讓凝膠聚合大約1 h。在凝膠聚合過程中,將7 L1 xT A E緩沖液加入電泳槽中,預熱到60℃。

凝膠完畢后拔走梳子,將膠放入到電泳槽內,清洗點樣孔。

將DNA樣品和6 xLoadingB uf f e r以5∶1比例混合,開始上樣,上樣量為10～20μL。

待電泳溶液溫度達到60℃時,開始電泳。在30 V電壓條件下,電泳30 min；然后將電壓調制150 V條件下,電泳4.5 h。

電泳完畢后用E B染色,然后用Q ua nt i t y0 ne（B i o-R a d）拍照。

1.5 DGGE條帶的切割、克隆與測序

對D G G E膠片上的主要條帶進行割膠回收DNA,經第2次P C R擴增后,用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,然后對所有條帶的P C R產物測序（由上海生物工程公司代測）。

2 結果和分析

2.1 16Sr DNAV 3區特征片段DGGE指紋圖譜

對D G G E膠片上的主要條帶進行割膠回收DNA（條帶1-52）,經第2次P C R擴增后,用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,然后對所有條帶的P C R產物進行測序。由于31個條帶在割膠回收后,經P C R擴增后濃度太低,無法測序,所以沒有得到這31個條帶的序列。圖1中D G G E圖譜條帶的數量可反映樣品的細菌多樣性,條帶信號的強弱可反映細菌的相對數量。

圖1 蜜蜂消化道內含物中細菌群落的D G G E圖譜

2.2 春夏季健康蜜蜂腸道中細菌群落組成

在春季,健康蜜蜂腸道的主要有乳酸桿菌屬、熒光假單胞菌、梭狀芽孢桿菌屬、γ-變形桿菌屬、腸桿菌屬；在夏季健康蜜蜂腸道的主要有乳酸桿菌屬、熒光假單胞菌、梭狀芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、明串珠球菌屬、沙雷氏菌屬、隆德假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬。

2.3 健康蜜蜂與患爬蜂病、白堊病蜂腸道中細菌種類組成

結合D G G E圖譜可知,患有爬蜂病的病蜂腸道中細菌有乳酸桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、γ-變形桿菌屬、腸桿菌屬、惡臭假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、大亞灣細菌、明串珠球菌屬,而患有白堊病病蜂腸道中細菌有乳酸桿菌屬、熒光假單胞菌、明串珠球菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬。

3 小結與討論

通過將測序所得的16S r DNA的V 3區序列與N C B I數據庫中已知的序列進行相似性比較發現,蜜蜂腸道內含物主要有乳酸桿菌屬、明串珠球菌屬、惡臭假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、大亞灣細菌、梭狀芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、熒光假單胞菌、瘤胃細菌屬、γ-變形桿菌屬、隆德假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬。該結論與從蜜蜂腸道分離培養并通過生理生化鑒定所得到的結果基本一致［7-9］。

從春季與夏季的健康蜜蜂腸道中細菌群落組成來看,在夏季蜜蜂腸道的細菌種類比春季有所增加,這說明在春夏不同季節的蜜蜂對腸道內細菌群落產生了影響。蜜蜂腸道內細菌菌群結構差異明顯。

通過16S r DNA片段的D G G E圖譜發現,健康蜜蜂腸道中細菌菌落多樣性高于患爬蜂病、白堊病病蜂腸道中細菌多樣性。

本研究發現蜜蜂腸道內細菌對蜜蜂個體和群體的健康都有重要意義,蜜蜂腸道細菌生物學功能多樣,具有很強的實用性。通過研究,為調節和改善蜜蜂腸道微生態環境構建蜜蜂腸道細菌種質資源庫和揭示蜜蜂腸道微生物的種類、作用及進一步探討其對蜜蜂成蟲的生命活動影響奠定基礎和提供理論依據。

［1］ 金湯東,陳盛祿,錢建華,等.我國蜜蜂疾病發生趨勢與防治技術［J］.中國蜂業,2007,58（2）：23-24.

［2］ 顏珣,韓日疇.我國蜜蜂主要病原檢測技術［J］.昆蟲知識,2008,45（3）：483-488.

［3］ 周婷.從病理學角度談談病原微生物與蜜蜂的免疫防御機能［J］.中國養蜂,1996（3）：12-13.

［4］ 崔海輝,楊權興,李波.利用組合益生菌對蜜蜂無公害蜂病防治技術的研究［J］.中國蜂業,2011,62（10）：37-39.

［5］ 孫曉媛,李影,錢愛東.開發未可培養微生物技術的研究進展［J］.微生物學通報,2008,35（5）：798-802.

［6］ 丁林賢,蘇曉梅,橫田明.活的但非可培養（V B N C）狀態菌的研究進展［J］.微生物學報,2011,51（7）：858-862.

［7］ 楊志波,張紹升.蜜蜂腸道細菌菌群結構及其季節性變動［J］.中國蜂業,2010,61（5）：11-14.

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（責任編輯：張瑞麟）

S 89文獻標志碼：A文章編號：0528-9017（2014）05-0759-02

2014-01-04

杭州市種子種苗項目（20120332H 09）

崔海輝（1979-）,男,副教授,本科,研究方向為食品生物技術,E-mail：c ui ha i hui@s i na.com。

文獻著錄格式：崔海輝.蜜蜂消化道內含物細菌群落組成的PCR-DGGE分析［J］.浙江農業科學,2014（5）：759-760,764.