高效液相色譜法快速測定乳粉中的三聚氰胺與雙氰胺

楊 嘉，丁娟芳，周元元，徐 秋，朱 姜，王 帥

（1.揚州市產品質量監督檢驗所，江蘇 揚州 225111；2.揚州職業大學生物與化工工程學院，江蘇 揚州 225009）

高效液相色譜法快速測定乳粉中的三聚氰胺與雙氰胺

楊 嘉1，丁娟芳2，周元元1，徐 秋1，朱 姜1，王 帥1

（1.揚州市產品質量監督檢驗所，江蘇 揚州 225111；2.揚州職業大學生物與化工工程學院，江蘇 揚州 225009）

建立高效液相色譜-二極管陣列檢測器同時檢測乳粉中三聚氰胺和雙氰胺的分析方法。采用1%三氯乙酸溶液提取樣品中的三聚氰胺和雙氰胺，氨基柱為分析柱，流動相為乙腈-水（75∶25，V/V），流速1.0 mL/min，檢測波長23 3 nm。2種物質在0.005～60 mg/L范圍內與其峰面積線性關系良好，不同添加水平的回收率在83.2%～102.6%，三 聚氰胺和雙氰胺的方法定量限分別為0.17、0.15 mg/kg，方法變異系數為2.3%～7. 2%（n=6）。此方法操作簡便、快速、成本低，適用于乳粉中三聚氰胺和雙氰胺的同時檢測。

高效液相色譜；二極管陣列檢測器；乳粉；三聚氰胺；雙氰胺

近年來，國內外乳品質量安全事件頻發，2008年三鹿奶粉三聚氰胺事件和2013年1月新 西蘭乳品的雙氰胺事件由于關系到未成年人這個特殊的消費群體，引起了社會各界的廣泛關注。

三聚氰胺，化學式C3H6N6，又稱蜜胺或氰尿酰胺，是一種重要的氮雜環有機化工原料。部分不法分子通過向乳品中添加三聚氰胺來提高產品的含氮量，謀取不法利潤；一些食品包裝材料中也含有三聚氰胺，與食品接觸時會發生微量遷移[1]。雙氰胺，化學式C2H4N4，化肥工業中常用作硝化抑制劑以提高氮肥利用率和減少氮肥對環境的污染[2-3]，奶牛攝食噴灑了雙氰胺的牧草后，分泌的乳汁中會有少量殘留；與三聚氰胺一樣，雙氰胺也是成本低廉且性狀穩定的非蛋白類高氮物質，極有可能以較高的質量濃度被非法添加到食品中。資料顯示，2種物質都會對人體健康構成已知或潛在的威脅[4-6]，不同來源的添加或帶入使得產品中目標物的質量濃度值可能會橫跨多個數量級，所以研究建立快速、低成本、線性范圍寬的檢測方法很有意義。

目前，三聚氰胺的檢測方法比較成熟，除常用的色譜檢測法（液相色譜法[7-8]、液相色譜-質譜法[9]、氣相色譜-質譜法[10]等）外，還有光譜檢測法[11-12]、免疫學檢測法[13]等多種方法。食品中雙氰胺的檢測方法也有報道[14-17]，利用液相色譜-質譜法進行檢測，雖然在分辨率和靈敏度方面有一定優勢，但硬件配置門檻較高，推廣應用受到一定限制。目前，食品中三聚氰胺和雙氰胺的同時檢測方法未見報道，本實驗旨在建立一種快速、有效的檢測方法，為這2 種物質的同時測定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉 外來送檢樣品。

三聚氰胺、雙氰胺標準品（純度99%） 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙醇、乙腈（均為色譜純）美國Tedia公司；氨水、丙酮、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鉛、三氯乙酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水符合GB/T 6682—2008《國家實驗室用水規格和試驗方法》分析實驗室一級水要求。

1.2 儀器與設備

1200高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）美國Agilent公司；Milli-Q Academic超純水儀 美國Millipore公司；CP225D型電子天平 德國Sartorius公司；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司；0.22 μm針式微孔濾膜過濾器 上海安譜公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：A s a h i p a k N H 2 P-5 0 4 E氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進樣量10 ?L；流動相乙腈-水（75∶25，V/V），其中每100 mL水中添加25%氨水0.2 mL；流速1.0 mL/min；檢測波長233 nm。

1.3.2 標準溶液的配制

準確稱取三聚氰胺、雙氰胺標準品，用甲醇溶解得到質量 濃度均為1 000 mg/L的標準儲備液，用甲醇稀釋標準儲備液，配制成不同質量濃度的標準使用液（表1），繪制標準曲線，確定線性范圍。

表 1 標準溶液質量濃度Table 1 Serial dilution concentrations of standard solutions of melamine and dicyandiamide

1.3.3 樣品處理

稱取2 g均勻樣品（準確至0.000 1 g），置于50 mL具塞刻度試管中，加水10 mL，充分溶解后加入1%三氯乙酸溶液定容至滿刻度，劇烈振蕩5 min后靜置20 min，上清液經0.22 μm水系濾膜過濾，供儀器分析使用。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱

三聚氰胺和雙氰胺都含 有胺基，具有較強的極性，因此在傳統的C8和C18反相柱上不易保留，需要使用離子對試劑，后者也是藥物分析中檢測雙氰胺的常用方法[18]。利用C18柱配合離子對試劑對目標成分進行色譜條件的優化，但由于食品基體成分的復雜性，目標物的同時分離效果不佳。氨基柱能用于分離極性較大的物質，根據待測物質的性質和文獻[19-20]報道，本實驗最終選擇氨基柱作為分析色譜柱。

2.1.2 檢測波長

取質量濃度為2.0 mg/L的混合標準使用液及待檢樣品處理液，在190～400 nm波長處進行掃描，發現2 種物質在213 nm和233 nm波長處有較大的共同吸收峰（圖1）。由于甲醇和乙腈在213 nm波長附近有紫外吸收，故選擇譜圖干擾較少的233 nm作為檢測波長。

圖1 三聚氰胺和雙氰胺的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of melamine and dicyandiamide

2.1.3 流動相

圖2 混合標樣（2.0 mg/L）（A）、添加混合標樣的陰性樣品（1.0 mg/kg）（B）色譜圖Fig.2 Chromatograms of mixed standards (2.0 mg/L) (A) and blank sample spiked with mixed standards (1.0 mg/kg) (B)

比較了乙腈和水的不同配比，結合標樣色譜圖峰形和樣品 處理液的分離效果（圖2），確定了最佳的流動相條件為乙腈-水（75∶25，V/V）。由于提取試劑三氯乙酸溶液顯酸性，所以在流動相中加入了少量氨水以防止氨基柱鍵合官能團的水解，延長色譜柱的使用壽命。

2.2 提取方法的優化

根據2 種 物質的溶解 性并參考相關文獻[21-22]，選擇了甲醇、乙 醇、乙腈、丙酮和1%三氯乙酸作為提取試劑進行定容，配合2 種沉淀方法（1.加水溶解樣品后加入1.5 mL 10%亞鐵氰化鉀和1.5 mL 20%乙酸鋅；2.加水溶解樣品后加入2 mL 20 g/L乙酸鉛）進行提取條件的篩選和優化。實驗中樣品加標質量濃度為2.0 mg/kg，每組條件平行測定3次。從表2可以看出，不使用沉淀劑，直接用甲醇或1%三氯乙酸定容、振蕩提取，三聚氰胺和雙氰胺的平均回收率均能達到90%以上。用相同的實驗條件重復測定6次，進行統計分析，結果顯示，甲醇和三氯乙酸對雙氰胺的回收率平均值相近，且差異不顯著；而三氯乙酸對三聚氰胺的提取效果略優于甲醇（表3）。

三氯乙酸是國際上常用的檢測蛋白含量 的預處理方法，可實現樣品中蛋白態氮與非蛋白態氮的分離[23]，本實驗也采用該方法對樣品進行前處理。

表 2 不同提取方法的 回收率（n =3）Table 2 The re c overies of melamine and dicyandiamide by different extraction methods (n = 3)

表 3 甲醇和1%三氯乙酸提取方法回收率（ n=6）Table 3 The recoveries of melamine and dicyandiamide using methanol or 1% trichloroacetic acid solution as the extraction solvent (n = 6)

2.3 方法線性范圍、回收率、精密度、檢出限和定量限

按1.3.2節配制混合標準使用液、按1.3.1節色譜條件進行測定，以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制曲線，在不同質量濃度范圍內，標準品的質量濃度與峰面積值具有良好的線性關系；以基線噪聲3倍峰面積對應的樣品檢出濃度作為檢出限，以10倍峰面積對應的樣品檢出濃度作為定量限。準確稱取陰性樣品，進行3個水平的加標測試，每個水平測定6次，計算回收率和精密度，結果見表4。結果顯示，不同添加水平下，回收率和變異系數均滿足實驗室分析要求。

表 4 方法線性范圍 、回收率、精密度、檢出限和定量限（ n=6）Table 4 Linear range, recovery, repeatability, LOD and LOQ of the method ( n= 6)

我國規定了三聚氰胺在嬰兒配方食品中的限量值為1 mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg[24]。雙氰胺污染目前尚不具有顯著的公共衛生意義，國家也未制定限量標準，有資料顯 示其毒性低于三聚氰胺[4]。綜合上述情況，本檢測方法的定量限完全能夠滿足日常食品檢驗的要求。

2.4 實際樣品的測定

使用本方法對外來送檢的34個乳粉樣品進行了檢測，其中有16個樣品標稱為進口奶源。結果在其中一個進口原料乳粉中檢出雙氰胺殘留，其含量為為0.72 mg/kg，而三聚氰胺未檢出。雙氰胺陽性樣品色譜圖見圖3。

圖3 陽性樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of positive sample

3 結 論

本實驗建立了高效液相色譜法同時測定乳粉中三聚氰胺和雙氰胺質量濃度的檢測方法，通過1%三氯乙酸溶液的提取及氨基色譜柱的分離，取得了較理想的實驗效果，方法精密度和回收率能滿足實際檢測的要求。本方法前處理簡單、操作性強，利用二極管陣列檢測器進行定性，成本低于質譜檢測法，降低了實驗室檢測的門檻，易于推廣，適用于日常檢測中的分析定量。

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Rapid De termination of Melamine and Dicyandiamide in Milk Powder by High Performance Liquid Chromatography

YANG Jia1, DIN G Juan-fang2, ZHOU Yuan-yuan1, XU Qiu1, ZHU Jiang1, WANG Shuai1
(1. Yangzhou Products Quality Supervision and Inspection Institute, Yangzhou 225111, China; 2. College of Biological and Chemical Engineering, Ya ngzhou Polytechnic College, Ya ngzhou 225009, China)

A high performance liquid chromatography-diode array detector (DAD) method was developed for rapid and simultaneous determination of melamine and dicyandiamide in milk powder. Melamine and dicyandiamide were extracted with 1% trichloroacetic acid solution. The chromatographic separation was performed on an amino column using acetonitrile-water (75:25, V/V) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min, and the analytes were detected with a DAD detector at 233 nm. Th e t wo compounds were well separated with a good linear relationship in the wide range of 0.005–60 mg/L. The av erage recoveries in milk powder were in the range of 83.2%–102.6% at several spiked levels. The lowest limits of quantification for melamine and dicyandiamide were 0.17 and 0.15 mg/kg, respectively, and the precision of the method expressed as coe fficient of variance (CV) was in the range of 2.3%–7.2% (n = 6). This method is simple, rapid, low-cost and suitable for the simultaneous determination of melamine and dicyandiamide in milk po wder.

high performance liquid chromatography; diode array detector; milk powder; melamine; dicyandiamide

TS207.3

A

1002-6630（2014）06-0172-04

10.7506/spkx1002-6630-201406037

2013-07-03

楊嘉（1982—），男，工程師，碩士，研究方向為食品檢驗技術。E-mail：jiajia82112001@163.com