反相高效液相色譜法測定調味品中7種合成工業染料

陳永艷，蔣麗娜，屈飛飛，劉衛東

（1.中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所，北京 100050；

2.北京市海淀區疾病預防控制中心，北京 100094；3.北京食品科學研究院，北京 100050）

反相高效液相色譜法測定調味品中7種合成工業染料

陳永艷1,2，蔣麗娜3，屈飛飛2，劉衛東2

（1.中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所，北京 100050；

2.北京市海淀區疾病預防控制中心，北京 100094；3.北京食品科學研究院，北京 100050）

建立測定調味品中7 種工業合成染料的高效液相色譜法。樣品經乙腈超聲提取后，10 000 r/min離心10 min，取上清液進行分析，以0.02 mol/L乙酸銨溶液和乙腈溶液為流動相進行梯度洗脫，二極管陣列檢測器測定。結果表明：7 種工業合成染料的分離效果良好，回收率為86.8%～106.0%，相對標準偏差為1.07%～5.44% （n=5）；檢出限為0.2～0.5 mg/kg。該方法操作簡單快速，結果準確，重復性好，適用于調味品中7 種工業合成染料的同時測定。

反相高效液相色譜；工業合成染料；調味品

自2003年5月法國首先發現了紅辣椒粉制品中蘇丹紅Ⅰ至今，食品中添加工業染料的違法事件層出不窮，食品安全備受關注，食品安全不僅僅關乎百姓的身體健康，更關系到社會的和諧發展。由于工業染料種類繁多，且不法商販把其添加到食品中，給食品日常監管帶來較大困難，更給消費者的健康帶來很大的危害。國際癌癥研究機構將蘇丹紅歸為三類致癌物，我國及歐盟等國家已禁止其作為食用色素。堿性橙具有致癌、致畸變性。根據美國衛生研究所化學品健康與安全數據庫資料，攝取、吸入以及皮膚接觸該物質均會造成急性和慢性的中毒傷害，GB 2760—2007《食品添加劑衛生標準》規定，嚴禁將其作為食品添加劑使用。早在20世紀末，歐美、日本等國家和地區就己明令禁止將羅丹明B用于食品加工中，我國也將其列入《食品中可能違法添加的非食用物質名單（第一批）》進行重點監管。但由于以上7 種工業燃料具有價格低廉、著色穩定、色澤鮮艷等特點，在利益的驅動之下，某些不法商販利用這些特點，將其作為色素用于食品生產與加工，給消費者帶來潛在的危害和巨大的風險，因此建立一套快速、準確且可同時測定多種食品中非食用色素的測定方法具有重要意義，也可為日常監管提供有力的技術保障。

蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ為親脂性偶氮染料，其檢測方法多為電分析法[1-2]、熒光猝滅法[3]、酶聯免疫吸附測定法[4]、液相色譜法[5-9]，堿性橙Ⅱ、酸性橙Ⅱ、羅丹明B為親水性染料，由于其酸堿性不同，檢測方法通常包括熒光法[10-11]、液相色譜法[12-16]、液-質聯用法[17]，目前液相色譜法較為普遍。液相色譜-串聯質譜法可同時測定幾十種工業染料[18-22]，雖然準確度精密度高，但需要大型儀器設備，操作繁瑣，檢測成本較高，因而使用液相色譜法初篩更為普遍，簡單快速。目前國標方法尚不能實現對以上7 種工業染料同時檢測。本實驗擬建立一種簡單快速、具有良好的重復性、檢出限的測定方法，為快速檢測各種調味品紅色系工業染料的方法提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒粉、辣椒醬、五香粉、花椒等 市售。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Fisher公司；二氯甲烷（色譜純）、乙酸銨（色譜純）；堿性橙（C.I.11270） 上海安譜科學儀器有限公司；酸性橙Ⅱ （純度87.0%）、羅丹明B（純度95.0%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；蘇丹紅Ⅰ（純度96.1%）、蘇丹紅Ⅱ（純度87.5%）、蘇丹紅 （純度91.2%）、蘇丹紅Ⅳ（純度82.5%） 中國計量科學研究院。

1.2 儀器與設備

LC-10ATvp高效液相色譜系統（配有二極管陣列檢測器和CLASS-VP色譜工作站） 日本島津公司；Millipore純水系統 美國Millipore公司；3K15離心機美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：X bridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：乙腈（A）-0.02 mol/L乙酸胺溶液（B）；梯度洗脫程序：0～5.0 min，35%～60% A；5.0～10.0 min，60%～90% A；10.0～26.0 min，90%～90% A；26.0～30.0 min，90%～35% A。

1.3.2 樣品處理

稱取2 g樣品于50 mL帶蓋離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻后超聲提取20 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液于另一離心管中，殘渣用10 mL乙腈再提取1次，合并上清液，定容至20 mL。提取液中加入2.5 mL水和約0.5 g氯化鈉，渦旋混勻后冷凍放置2 h，取出后10 000 r/min離心10 min，取乙腈層進行液相色譜分析。

1.3.3 標準曲線繪制

酸性橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ、羅丹明B標準物質分別用純水溶解，乙腈定容配制質量濃度為1 000 mg/L（按純度標示折算）的單標準儲備液。蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標準物質分別用二氯甲烷溶解，乙腈定容配制質量濃度為1 000 mg/L（按純度標示折算）的單標準儲備液。再分別準確吸取質量濃度為1 000 mg/L的單標準儲備液各10 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容得100 mg/L的7 種混合標準溶液。使用時用流動相將混合標準溶液稀釋成0.05、0.1、0.5、1、5、10、15 mg/L質量濃度的標準溶液進行高效液相色譜分析，以標準工作液的質量濃度為橫坐標，各物質的峰面積為縱坐標，繪制各物質標準曲線。

1.3.4 回收率實驗

添加回收率實驗樣品處理同1.3.2節，以辣椒粉為典型代表，在辣椒粉樣品中7 種被測物質的添加量為2.5、5、10 mg/kg。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

由于目標化合物的化學結構不同，每種物質的最大吸收波長有所區別；7種染料的最大吸收波長在410～550 nm之間。為減少數據分析時間在兼顧靈敏度的前提下選擇適宜分析波長，本實驗采用堿性橙Ⅱ在410 nm波長處測定；酸性橙Ⅱ、蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ在485 nm下測定；蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ在510 nm波長處測定；羅丹明B在550 nm波長處測定。

2.2 流動相的選擇

蘇丹紅所需流動相組成簡單，一般為甲醇-水、乙腈-水。蘇丹紅水溶性低，為獲得適宜的柱效和保留時間，流動相中有機相含量通常較高；酸性橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ及羅丹明B親水性強，流動相中乙酸銨對酸性橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ、羅丹明B分離影響較大。如圖1所示，通過對流動相中0、0.02、0.03 mol/L乙酸銨進行對比，不添加乙酸銨不能改善目標化合物峰形及分離，乙酸銨濃度過高在梯度洗脫中與高比例有機相易發生鹽結晶，損壞儀器。通過實驗對比，選定0.02 mol/L為流動相鹽濃度。

圖1 乙酸銨濃度對分離的影響Fig.1 Effect of ammonium acetate concentration on peak shape

本實驗對乙酸銨溶液中酸度變化對分離的影響進行了研究，通過乙酸調節，在pH值為4.1、4.6、5.6進行對比，發現酸性橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ、羅丹明B的保留時間會有所變化但均不影響分離，對蘇丹紅色系列無任何影響，為簡化流動相條件本實驗選擇不調節pH值。

經過反復實驗考察，最終確定得到1.3.1節的色譜實驗條件，在波長485 nm條件下7 種工業染料的標準物質譜圖見圖2。

圖2 標準品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 7 industrial synthetic dye standards

2.3 提取條件的選擇

本實驗選擇乙腈、丙酮-水（90∶10，V/V）、乙腈-丙酮（90∶10，V/V）作為提取液進行對比，并對辣椒粉、花椒粉進行提取條件優化實驗。圖3表明，3 種提取溶劑對堿性橙以外的6種工業染料提取效率沒有顯著性差異，乙腈對堿性橙的提取效果明顯優于丙酮-水（90∶10，V/V）、乙腈-丙酮（90∶10，V/V）的提取效果。為提高提取回收率，采用將20 mL乙腈分2次提取，每次10 mL，回收率滿足實驗要求，不再進行第3次提取，以簡化實驗步驟。提取液中加入2.5 mL水和約0.5 g氯化鈉，將氯化鈉加入乙腈提取液中，增強離子化效應，使乙腈與水分層，同時也使提取目標物更完全地溶于乙腈中。

圖3 提取溶劑對不同染料回收率的影響Fig.3 Effect of extraction solvents on the average recoveries of industrial synthetic dyes

2.4 線性實驗

根據1.3.3節配制不同質量濃度的混合標準溶液，以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，分別作出堿性橙Ⅱ、酸性橙Ⅱ、羅丹明B、蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的標準工作曲線，線性關系實驗結果如表1所示。

表 1 線性關系實驗結果Table 1 Linear regression equations and limits of detection of seven industrial synthetic dyes

2.5 方法的檢出限、回收率和精密度

表2 回收率實驗（n =5）Table 2 Results of recovery tests (n == 55))

圖4 辣椒粉空白樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of blank sample of chili powder

采用在空白樣品中添加標準溶液的方法，對調味品中蘇丹紅染料進行3次添加回收率重復實驗，分別在陰性的辣椒樣品基質中添加2.5、5.0 mg/kg和10.0 mg/kg 3 種水平的7 種混合標準溶液，按1.3.2節方法進行預處理，每個水平重復測定5次。分別計算平均回收率和相對標準偏差；以信噪比（RSN）大于3為方法檢出限，結果如表2所示。陰性的辣椒樣品譜圖及加標水平為10 mg/kg的樣品加標譜圖見圖4、5。

圖5 辣椒粉空白樣品加標色譜圖Fig.5 Chromatogram of blank sample of chili powder spiked with 7 industrial synthetic dyes

2.6 實際樣品測定

本方法建立了同時測定調味品中7 種工業染料的高效液相色譜法，通過對實驗條件進行選擇和優化，確定了色譜條件，7 種目標物可完全達到基線分離。該方法簡單快速，結果準確可靠，適用于調味品中工業合成染料的檢測。收集了農貿市場、超市銷售的辣椒粉、五香粉、花椒等20個調味品樣品采用本實驗方法進行7 種工業染料檢測，未發現陽性樣品。圖6、7分別為花椒、五香粉的實際樣品測定譜圖。

圖6 花椒樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of Pericarpium Zanthoxyli

圖7 五香粉樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of five-spice powder

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Determination of Seven Industrial Synthetic Dyes in Condiments by RP-HPLC

CHEN Yong-yan1,2, JIANG Li-na3, QU Fei-fei2, LIU Wei-dong2
(1. Institute of Environmental Health and Related Product Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China; 2. Beijing Haidian District Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100094, China; 3. Beijing Academy of Food Science, Beijing 100050, China)

An HPLC method for the determination of seven industrial synthetic dyes in condiments was established. Samples were extracted with acetonitrile under ultrasonic-assisted conditions and the extract was centrifuged. The supernatant was then analyzed by HPLC-DAD with gradient elution using a mobile phase consisting of 0.02 mol/L ammonium acetate and acetonitrile and quantified by an external standard method. The concentrations of seven industrial synthetic dyes showed good linearity with peak area, and good separation was achieved for them. Their recovery rates from a spiked sample were in the range of 86.8%–106.0%, and the relative standard deviations were 1.07%–5.44% (n = 5). The detection limits were in the range of 0.2–0.5 mg/kg. In conclusion, this method is rapid, simple, sensitive, accurate and reproducible, and has a good applicability to the simultaneous determination of seven industrial synthetic dyes in condiment products.

high performance liquid chromatography; condiment; industrial synthetic dyes

TS202.3

A

1002-6630（2014）06-0168-04

10.7506/spkx1002-6630-201406036

2013-08-23

陳永艷(1981—)，女，檢驗師，碩士，研究方向為衛生檢驗。E-mail：chenyongyan1934@163.com